發(fā)布時(shí)間：2020-04-16 02:04

【摘要】： 目的 支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞,包括炎性細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等)、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞(氣道平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。雖然已開(kāi)展了較多關(guān)于哮喘的研究與治療工作,但由于哮喘的發(fā)病機(jī)制始終未得到完全闡明,因此,目前哮喘仍是無(wú)法治愈的疾病之一。 肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage,AM)是定居在肺泡和氣道表面的重要免疫效應(yīng)細(xì)胞,可以激活炎癥反應(yīng)消除入侵者。但是,過(guò)度的炎癥反應(yīng)可以干擾氣體交換。這就意味著AM有兩方面相反的作用-即保護(hù)機(jī)體免受侵害和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的作用。有研究顯示,AM占支氣管肺泡灌洗液(bronchus alveolar lavage fluid,BALF)中細(xì)胞總數(shù)的90%以上,但其在哮喘發(fā)病中的作用至今不是十分清楚。本實(shí)驗(yàn)研究哮喘大鼠AM鉀通道活性的變化情況及其生成各種炎癥因子的變化從而分析AM在哮喘時(shí)功能狀態(tài)的變化及其可能的調(diào)控機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法 首先利用卵蛋白(ovialbumin,OVA)致敏并激發(fā)大鼠建立哮喘模型,對(duì)照組則用生理鹽水代替;HE染色觀察哮喘大鼠的病理學(xué)變化情況;末次激發(fā)后24小時(shí)將大鼠麻醉,進(jìn)行氣管插管,用冷的PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,每次10ml,重復(fù)五次,收集BALF,回收率可達(dá)90%以上,分離并培養(yǎng)AM。利用全細(xì)胞電壓鉗模式記錄AM細(xì)胞膜上的電壓依賴(lài)性鉀通道(Voltage-dependent potassium channel,K_v)電流,觀察比較哮喘模型組和對(duì)照組K_v通道活性的變化;兩組細(xì)胞在利用LPS(5ug/ml)處理12小時(shí)前后,通過(guò)RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞中IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平;利用大鼠ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)LPS(5ug/ml)處理12小時(shí)前后肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α的分泌水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、AM細(xì)胞膜Kv電流變化:病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)哮喘模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加,有大量紅細(xì)胞滲出,氣道平滑肌明顯增厚,管腔內(nèi)可見(jiàn)粘液栓;哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞總數(shù)顯著增高,與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01),但AM百分比無(wú)明顯差異(P＞0.05);應(yīng)用Kv通道特異性阻斷劑4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)后電流幅度明顯降低,證實(shí)檢測(cè)到的AM細(xì)胞膜上的電流為Kv電流;哮喘大鼠AM細(xì)胞Kv電流密度為[(32.65±18.82)pA/pF,n=11]較對(duì)照組[(87.57±33.14)pA/pF,n=11]明顯降低(P＜0.01)。 2、AM分泌IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的變化:LPS處理前后哮喘組AM轉(zhuǎn)錄、表達(dá)IL-6和TNF-α的水平與對(duì)照組相比均明顯增高(P＜0.05);LPS處理之前哮喘組AM分泌IL-6和TNF-α水平與對(duì)照組相比顯著增高(P＜0.01),LPS處理可使哮喘組與對(duì)照組的AM分泌IL-6和TNF-α水平均明顯增高(P＜0.01),但使對(duì)照組AM分泌IL-6和TNF-α的水平升高更為明顯,從而使哮喘組AM分泌IL-6和TNF-α水平與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 1、哮喘大鼠AM細(xì)胞膜上Kv通道電流密度降低,活性減小。 2、哮喘大鼠AM分泌TNF-α、IL-6水平顯著增高,LPS處理使AM分泌TNF-α、IL-6作用增強(qiáng),但對(duì)正常AM作用更為明顯。
【圖文】：

AM細(xì)胞膜上Kv電流的鑒定

4、哮喘大鼠AM細(xì)胞膜上Kv電流的變化哮喘模型組AM細(xì)胞Kv電流峰值明顯低于對(duì)照組(見(jiàn)圖3)。 +5omV時(shí)方波刺激所得的模型組Kv電流密度(見(jiàn)圖3A)[(32.65士 18.82)pA/pF，n=川較對(duì)照組(見(jiàn)圖3B)〔 (87.57士33.14)p刀pF，n一川明顯降低(P<0.01);其電流電壓之間的關(guān)系(見(jiàn)圖3C)所示。B+somv~羹啊匕5腸ms1(pA)V(mV)I一V曲夔戈圖3，大鼠AM細(xì)胞膜Kv電流的比較(mean士SD，n=11)A:正常對(duì)照組大鼠AM細(xì)胞膜上的Kv電流實(shí)測(cè)圖;B:哮喘組大鼠AM細(xì)胞膜上的Kv電流實(shí)測(cè)圖;C兩組大鼠AM細(xì)胞膜上相應(yīng)的Kv電流一電壓曲線。5、LPs處理前后TNF一a的轉(zhuǎn)錄水平變化對(duì)照組AM用LPS激活前TNF一a轉(zhuǎn)錄水平為(0.17士0.04)與LPS處理之后的(0.64士0.32)相比，差異具有顯著性(P<0.05，，n二5)。模型組AM用LPS處理后其TNF一a的轉(zhuǎn)錄水平由 (0.58士0.20)增加到 (l.02士0.10)，具有顯著性差異(尸<0.05
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2629268