【摘要】： 在工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的異氰酸鹽是甲苯二異氰酸鹽(Toluene Diisocyana,TDI),是引起職業(yè)性哮喘最常見的原因。暴露TDI環(huán)境的工人,約有5%-15%發(fā)展為哮喘,明顯高于普通人群,且誘發(fā)的哮喘經(jīng)常發(fā)展為重癥哮喘。TDI哮喘的病理和臨床表現(xiàn)基本上與過敏性哮喘相同,但針對TDI哮喘的發(fā)病機制研究還比較局限,很多環(huán)節(jié)尚不清,對其機制尤其是啟動機制的了解是對TDI哮喘能夠達到很好地診斷和治療的關(guān)鍵步驟。目前的研究提示TDI誘發(fā)哮喘的主要作用環(huán)節(jié)有兩個:其一是支氣管上皮細胞作為主要靶細胞,TDI對支氣管上皮細胞的作用,可能導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)的失常和生物活性因子的釋放,在TDI哮喘中扮演重要角色;其二是氣道粘膜下的抗原提呈細胞(如樹突狀細胞),TDI與體內(nèi)形成的大分子如TDI-HSA滲透到粘膜下組織被抗原提呈細胞提呈后產(chǎn)生活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)與支氣管上皮細胞產(chǎn)生的細胞因子一同活化淋巴細胞(包括Th1和Th2)、中性粒細胞等炎癥細胞,從而引起下游一系列炎癥反應(yīng)。最近Lee等研究表明血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)在TDI哮喘扮演關(guān)鍵角色,但TDI是否可直接作用于人支氣管上皮細胞(Humanbronchious epithelial cell,HBE)致VEGF表達增加,進而起動和促發(fā)氣道炎癥,引起氣道高反應(yīng)性的作用,尚不清楚。TDI-HSA等大分子抗原必須穿透支氣管上皮細胞為主組成的粘膜屏障才可作用于抗原提呈細胞,然而工業(yè)環(huán)境中允許的低濃度TDI是不會直接引起上皮細胞損害,TDI是否通過影響HBE通透性導(dǎo)致哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展還有待于進一部闡明。 所以本課題從兩個不同方面研究TDI對HBE的作用來初步探討TDI哮喘發(fā)病機制。 課題第一部分:甲苯二異氰酸鹽(TDI)對人支氣管上皮細胞血管內(nèi)皮生長因子表達的影響 方法: 1)制備TDI抗原結(jié)合物:應(yīng)用改良的Son M方法制備TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)。 2)觀察不同濃度的TDI-HSA和HSA對正常人支氣管上皮細胞株HBE135-E6E7細胞活力影響:觀察TDI-HSA對細胞活力影響時分為:對照組(不加TDI-HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育),20μg/mlTDI-HSA組,40μg/mlTDI-HSA組,60μg/mlTDI-HSA組,80μg/mlTDI-HSA組,100μg/mlTDI-HSA組(n=7);觀察HSA對細胞活力影響時分為:對照組(不加HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育HBE135-E6E7組),20μg/mlHSA組,40μg/mlHSA組,60μg/mlHSA組,80μg/mlHSA組,100μg/mlHSA組(n=8)。按上述分組刺激HBE135-E6E7 48小時后,用四唑鹽(MTT)比色法檢測細胞活力。 3)觀察不同濃度TDI-HSA對HBE135-E6E7 VEGF基因的影響:實驗分成9組:對照組(不加HSA及TDI-HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育),10μg/mlHSA組,20μg/mlHSA組,30μg/mlHSA組,40μg/mlHSA組,10μg/mlTDI-HSA組,20μg/mlTDI-HSA組,30μg/ml TDI-HSA組,40μg/ml TDI-HSA組(n=4)。按上述分組刺激HBE135-E6E7 12小時后,提取細胞總RNA,應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測HBE135-E6E7 VEGFmRNA。 4)觀察地塞米松對TDI-HSA誘導(dǎo)HBE135-E6E7 VEGF表達的影響:實驗分為4組:對照組(不加HSA及TDI-HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育),40μg/ml HSA組,40μg/ml TDI-HSA組,(40μg/ml TDI-HSA+1umol/L地塞米松)組,按上述分組刺激HBE135-E6E7 12小時后,提取細胞總RNA,應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測HBE135-E6E7 VEGF mRNA(n=4);刺激HBE135-E6E7 24小時后,用雙抗體夾心ELISA檢測各組上清液VEGF蛋白濃度(n=7)。 5)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理,計量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((?)±S)表示,不同組間用One Way ANOVA進行單變量方差分析,多重比較采用LSD法。 結(jié)果: 1) MTT比色法檢測不同濃度的TDI-HSA和HSA對HBE135-E6E7活力結(jié)果: 在TDI-HSA濃度分別為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml組對HBE135-E6E7細胞活力無顯著影響,100μg/ml則可顯著降低細胞活力(P0.001):HSA組:20μg/ml和40μg/ml組對HBE135-E6E7細胞活力無顯著影響),當(dāng)濃度增至60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml則增加細胞活力(P均0.05)。 2) RT-PCR法檢測不同濃度TDI-HSA對HBE135-E6E7 VEGF基因的影響結(jié)果: HBE135-E6E7組成性表達VEGF189、VEGFl65亞型基因,以VEGF165表達量較多。HBE135-E6E7 VEGF189基因和VEGF165基因在10μg/mlTDI-HSA組與10μg/ml HSA組以及對照組相比表達增加,但無顯著差異(P均0.05),在20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的TDI-HSA組與相應(yīng)濃度的HSA組以及對照組相比,兩亞型基因均表達顯著增加(P均0.05),且隨著TDI-HSA濃度的增加表達亦隨之增加(P均0.05);兩亞型基因在不同濃度HSA組之間表達無顯著差異(P均0.05),各濃度HSA組與對照組比較亦無顯著差異(P均0.05)。 3) RT-PCR、雙抗體夾心ELISA法檢測地塞米松對TDI-HSA誘導(dǎo)HBE135-E6E7VEGF表達的影響結(jié)果: HBE135-E6E7 VEGF189基因和VEGFl65基因在TDI-HSA組與對照組以及HSA組比較均顯著增加(P均0.001),(TDI-HSA+地塞米松)組與TDI-HSA組比較無顯著差異(P0.05);上清VEGF蛋白濃度在TDI-HSA紐與對照組以及HSA組比較增加3倍以上(P均0.001),(TDI-HSA+地塞米松)組與TDI-HSA組比較無顯著差異(P0.05),對照組與HSA組上清VEGF濃度比較無顯著差異(P0.05)。 結(jié)論: TDI-HSA在不影響細胞活力情況下以40μg/ml濃度時對HBE VEGF基因表達影響最大,并具有濃度依賴性。TDI在基因和蛋白水平上均可顯著上調(diào)HBEVEGF的表達,且不能被地塞米松所抑制。 課題第二部分:甲苯二異氰酸鹽(TDI)對人支氣管上皮細胞間通透性的影響及機制探討 方法: 分組:對照組(不加HSA及TDI-HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育),40μg/mlHSA組,40μg/ml TDI-HSA組,(40μg/ml TDI-HSA+0.02μg/mlVEGF)中和抗體組;按上述分組刺激HBE135-E6E7細胞24小時后,用FITC-右旋糖酐檢測細胞間通透性(n=6),用透視電鏡觀察細胞間間隙(n=3)。 結(jié)果: 1) FITC-右旋糖酐檢測TDI-HSA對HBE135-E6E7細胞間通透性的影響及VEGF通路在其中的介導(dǎo)作用: 細胞間通透性在TDI-HSA組與對照組以及HSA組比較增加2倍以上(P均0.001),在(TDI-HSA+VEGF中和抗體)組與TDI-HSA組比較有所下降(P0.001),(TDI-HSA+VEGF中和抗體)組與對照組以及HSA組比較亦有顯著差異(P均0.001),對照組與HSA組細胞間通透性比較無顯著差異(P0.05)。 2)透視電鏡觀察TDI-HSA對HBE135-E6E7細胞間間隙及VEGF及VEGF通路在其中的介導(dǎo)作用: TDI-HSA組可見細胞間局部連接疏松,緊密連接變少,見明顯空隙,(TDI-HSA+VEGF中和抗體)組仍可見細胞間局部連接疏松,見明顯空隙,對照組和HSA組的細胞間連接緊密,未見明顯孔隙。 結(jié)論: TDI明顯增加HBE間的通透性,加入VEGF中和抗體可部分逆轉(zhuǎn)TDI引起的HBE間通透性增加,TDI可能通過破壞支氣管上皮細胞的緊密連接導(dǎo)致通透性的增加,而VEGF中和抗體不能逆轉(zhuǎn)其緊密連接的改變。
【圖文】：

nnassay定性與定量檢測TDI·HSA中TDI濃度圖右為空白調(diào)零孔，其余為不同濃度的對甲苯胺標(biāo)準(zhǔn)品，第A孔。ntofisocyanateboundtoHSAdeterminedbymedi五皮細胞株HBEI35一E6E7的形態(tài)觀察鏡下觀察，可見HBE135一E6E7細胞呈不規(guī)瓶，當(dāng)細胞匯聚成單層細胞時，，呈鋪路石。

測不同濃度TDI一HSA和HSA對HBE135一E6E7胞作用產(chǎn)生棕色結(jié)晶物質(zhì)(見圖3)。細胞活力氣值)/(不加藥對照組A值一不加細胞組A值)度分別為Zop歲ml、40pg/ml、60pg/mlE7細胞活力無顯著影響，當(dāng)其增加至100pg/1);在HsA組:20pg/ml組和40pg/inl組HB影響，其后隨著濃度增加至60pg/ml、80pg/力(P均<0.05)。(見表1、表2、圖4、圖5)0pg/ml、30pglinl、40pg/Inl的HSA和TD察不同濃度TDI一SA對HBE135一E6E7VEGF
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R562

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李澤庚;張杰根;彭波;張念志;韓明向;;肺氣虛證患者血清IL-8、TNF的水平及臨床意義[J];浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2005年06期

2 趙海軍,丁亞春,劉婭,史杰萍,劉華鋒,張婕,成煥吉,崔燕南,侯松萍;腫瘤壞死因子啟動子基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年03期

3 劉政,姚婉貞,陳燕,丁艷苓;白細胞介素-9在慢性阻塞性肺病發(fā)病中的作用[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年04期

4 侯冬青;楊輝紅;李朝霞;李雙娥;;氣道反應(yīng)性/可逆性測定診斷咳嗽變異型哮喘的臨床觀察[J];中國醫(yī)師雜志;2006年01期

5 江濤;熊慧群;陳虹;唐小癸;;無創(chuàng)雙水平正壓通氣治療急性重癥哮喘64例臨床分析[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年04期

6 謝華,何韶衡,遲秀麗,陳萍;哮喘患者血漿類胰蛋白酶、IL-8和嗜酸性粒細胞趨化因子水平與類糜蛋白酶活性測定及相關(guān)性分析[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年16期

7 徐勁松,蔡紹曦,鄒飛,佟萬成,趙海金;應(yīng)用抑制消減雜交克隆支氣管哮喘病人嗜酸細胞差異表達基因[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年05期

8 趙海金,蔡紹曦,鄒飛,佟萬成,萬為人;應(yīng)用Super SMART cDNA合成技術(shù)擴增哮喘嗜酸性粒細胞總RNA[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年09期

9 黃少丹;陽雋;張世葉;田利奇;潘巧紅;;茶堿對慢性哮喘和肺功能改善的作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年03期

10 謝寶輝;鄧新宇;焦維克;;普米克都保治療38例輕度支氣管哮喘療效觀察[J];福建醫(yī)藥雜志;2007年01期

相關(guān)會議論文 前6條

1 張家騮;姚為群;張靜珊;;蟬地二陳湯加吸入療法治療輕中度哮喘42例觀察[A];第七次全國中西醫(yī)結(jié)合呼吸病學(xué)術(shù)交流大會論文匯編（二）[C];2004年

2 林江濤;何權(quán)瀛;姚婉貞;聶秀紅;張杰;許文兵;;北京市城區(qū)支氣管哮喘患者的控制現(xiàn)狀及對疾病認知程度的調(diào)查分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第一次大會論文匯編[C];2006年

3 蘇楠;林江濤;楊萌;陳欣;何潔;何權(quán)瀛;曹兆龍;陳寶元;肖毅;閻錫新;;妥洛特羅貼劑治療輕中度持續(xù)支氣管哮喘患者的有效性和安全性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第一次大會論文匯編[C];2006年

4 張曉巖;林江濤;李香凝;楊萌;俞紅霞;李桂琴;黃小杰;王萍;張嵐;周童亮;舒峻;;PAI-1基因多態(tài)性與支氣管哮喘氣道重塑關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第一次大會論文匯編[C];2006年

5 張曉巖;林江濤;劉翠麗;蘇楠;陳欣;舒峻;張嵐;周童亮;李桂琴;黃小杰;王萍;;纖溶酶原激活物抑制劑1基因多態(tài)性對支氣管哮喘發(fā)病及血漿纖溶酶原激活物抑制劑1水平影響的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第一次大會論文匯編[C];2006年

6 姜丕政;周煒煒;胡雅國;崔麗笙;;瀉肺定喘方治療支氣管哮喘療效觀察[A];第三屆浙江省中西部科技論壇論文集（第六卷 中西醫(yī)分卷）[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 辛?xí)苑?支氣管哮喘氣道重塑的臨床與實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

2 張弘;變應(yīng)性鼻炎與哮喘氣道炎癥的異同及吸入糖皮質(zhì)激素治療的影響[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

3 蔣雄斌;CD8～+T細胞在呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的哮喘中的作用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

4 劉可越;紫菀散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及新藥研制[D];天津大學(xué);2006年

5 孟憲明;支氣管哮喘病人外周血CD4～+ T淋巴細胞的自噬現(xiàn)象[D];吉林大學(xué);2007年

6 蔡紹曦;支氣管哮喘急性發(fā)作時嗜酸粒細胞活化的分子機制研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 謝世光;氣道激發(fā)試驗對支氣管哮喘患者氣道炎癥的影響及聯(lián)合吸入氟替卡松和沙美特羅的療效評價[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 凌嬋;羅格列酮對哮喘患者T淋巴細胞源性IL-10的影響及調(diào)節(jié)NF-κB的可能機制[D];中南大學(xué);2007年

2 康春燕;地塞米松對哮喘豚鼠氣道及肺表面活性物質(zhì)的影響[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2004年

3 徐勁松;應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)研究外周血嗜酸細胞支氣管哮喘相關(guān)基因的差異表達[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 張宏美;哮喘患者T細胞周期分布的調(diào)控機制及PS干預(yù)的意義[D];暨南大學(xué);2004年

5 宋云熙;西洛司特對COPD患者炎性介質(zhì)和細胞因子產(chǎn)生的抑制作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 郭志福;慢性哮喘小鼠氣道血管生成的變化及其在氣道重建中的意義[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

7 黃俊謙;白介素-10基因多態(tài)性與支氣管哮喘的相關(guān)性研究[D];青島大學(xué);2005年

8 張彩萍;地龍注射液對哮喘大鼠肺功能的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2005年

9 雷偉;血小板源性CD40/CD40配體在支氣管哮喘患者中的意義[D];蘇州大學(xué);2005年

10 夏武;中國南方漢族哮喘人群轉(zhuǎn)化生長因子-β_1基因啟動子多態(tài)性研究[D];江西醫(yī)學(xué)院;2005年

本文編號：2625081