【摘要】： 第一部分小鼠CCR7基因克隆 目的:從小鼠肺臟克隆出CCR7基因,為下一步利用腺病毒載體AdEasy system構(gòu)建AdCCR7打下基礎(chǔ)。 方法:以小鼠肺臟提取的總RNA為模板,設(shè)計合成擴增小鼠CCR7基因的特異性引物,加入特定的酶切位點,進行RT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用膠回收法純化目的基因CCR7,目的基因定向克隆至載體pMD-19,構(gòu)建質(zhì)粒pMD-CCR7,進行測序,與已知GeneBank中的CCR7基因進行序列比較,若有對導(dǎo)致編碼氨基酸改變的突變堿基則進行定點突變修復(fù)。 結(jié)果:克隆CCR7基因,序列測定表明CCR7基因有2個堿基突變,但不造成編碼氨基酸的改變,無需進行突變堿基定點修復(fù)。 結(jié)論:本研究成功克隆小鼠CCR7基因,確定無造成編碼氨基酸改變的突變堿基,無需進行突變堿基定點修復(fù)。 第二部分構(gòu)建重組腺病毒AdCTLA4Ig、AdCCR7 目的:應(yīng)用腺病毒載體系統(tǒng)AdEasy System構(gòu)建含有CTLA4Ig、CCR7基因的重組腺病毒AdCTLA4Ig、AdCCR7及其對照腺病毒AdGFP,為進一步應(yīng)用其進行誘導(dǎo)樹突狀細胞免疫耐受并回歸到肺組織的研究打下基礎(chǔ)。 方法:1.將目的基因CTLA4Ig克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV,堿裂解法提取質(zhì)粒,酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細菌內(nèi)進行同源重組,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdCTLA4Ig。2.將穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV直接酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細菌內(nèi)進行同源重組,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdGFP。3.將目的基因CCR7克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV,堿裂解法提取質(zhì)粒,酶切使之線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細菌內(nèi)進行同源重組,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdCCR7。將以上構(gòu)建的重組腺病毒質(zhì)粒以PacⅠ酶切法進行鑒定。成功重組的腺病毒質(zhì)粒用PacⅠ線性化后轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞HEK293,于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光以確定轉(zhuǎn)染效率,用RT-PCR法鑒定構(gòu)建效果。 結(jié)果:重組腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdGFP和pAdCCR7分別經(jīng)PacⅠ酶切后可見4.5Kb或3Kb和一條30Kb的條帶,表明同源重組成功。將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞HEK293后于熒光顯微鏡下可觀察到明亮的綠色熒光。將收集的病毒液做RT-PCR鑒定,結(jié)果表明重組腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdGFP和pAdCCR7構(gòu)建成功。 結(jié)論:成功構(gòu)建了重組腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdCCR7及對照腺病毒pAdGFP。 第三部分腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CTLA4Ig、CCR7基因修飾樹突狀細胞 目的:從小鼠骨髓分離單個核細胞,建立體外原代培養(yǎng)樹突狀細胞的方法,確定影響樹突狀細胞成熟的因素和CTLA4Ig、CCR7表達效率,構(gòu)建穩(wěn)定表達CTLA4Ig和CCR7基因的樹突狀細胞疫苗。 方法:從小鼠脛骨和股骨沖洗出骨髓,制成細胞懸液,在GM-CSF和IL-4作用下,體外培養(yǎng)7天。光學顯微鏡下觀察細胞生長狀況和形態(tài)學變化。流式細胞術(shù)(FACS)鑒定轉(zhuǎn)染細胞表型,確定為樹突狀細胞后,感染重組腺病毒并與OVA共同孵育。FACS鑒定細胞成熟狀態(tài),熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)目的基因表達及細胞生長狀態(tài),FACS和激光共聚焦技術(shù)檢測CTLA4Ig和CCR7兩種蛋白的表達及共表達情況。 結(jié)果:50%左右細胞具有CD11c表型,確定為樹突狀細胞。流式細胞術(shù)檢測AdCTLA4Ig和AdCCR7共感染的DC蛋白表達情況,約10.86%細胞表達CTLA4Ig,56.99%表達CCR7,10.04%為兩種蛋白的共同表達。激光共聚焦技術(shù)不僅可以觀測到胞膜胞漿還可觀測到胞核蛋白的表達。結(jié)果顯示,約80%以上細胞表達CTLA4Ig,90%以上表達CCR7,75%以上為兩種蛋白的共表達,而對照組AdGFP則無表達或低表達.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示經(jīng)AdCTLA4Ig和AdCCR7共感染的DC表型CD40、CD80和CD86表達均有所降低,尤其是CD80和CD86下降明顯。 結(jié)論:腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CTLA4Ig和CCR7修飾DCs可使DCs同時表達兩種蛋白分子,而共刺激分子CD40/CD80/CD86表達減少。 第四部分重組CTLA4Ig和CCR7誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細胞治療哮喘的研究 目的:通過尾靜脈回輸AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs,觀察其對哮喘小鼠氣道炎癥和Th失衡的干預(yù)作用以及免疫耐受反應(yīng)是否局限于局部肺組織。 方法:SPF級BALB/c小鼠40只,隨機分為正常對照組、哮喘模型組、AdGFP-DC對照組和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC干預(yù)組。哮喘模型組用OVA致敏和激發(fā);正常對照組用生理鹽水代替;AdGFP-DC對照組和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC干預(yù)組激發(fā)前2個小時分別回輸AdGFP-DC和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC,余處理同模型組。觀察哮喘的發(fā)作情況:肺組織病理切片檢測肺部病理損害,支氣管肺泡灌洗液檢測BALF中白細胞總數(shù)及分類,ELISA檢測BALF和血清中Th1、Th2類細胞因子,免疫熒光法檢測肺、腎、小腸組織CCR7蛋白表達水平。 結(jié)果:與AdGFP-Dc組小鼠比較,AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs尾靜脈回輸可明顯減輕小鼠的急性哮喘發(fā)作癥狀;減輕氣道炎癥和嗜酸性粒細胞浸潤;減輕肺部病理損害,降低氣道局部Th1、Th2類細胞因子,但對血清中細胞因子則無明顯調(diào)節(jié)作用。尾靜脈回輸AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs組小鼠肺組織CCR7蛋白表達較腎、小腸組織明顯增加,較其他組肺組織亦明顯增加。 結(jié)論:尾靜脈回輸AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs可明顯減輕小鼠急性哮喘發(fā)作癥狀,減輕肺部炎癥和嗜酸性粒細胞浸潤,調(diào)節(jié)氣道局部Th1和Th2細胞因子分泌,但對體液細胞因子的分泌調(diào)節(jié)作用有限;CCR7的表達可使DC回歸肺組織,避免全身免疫耐受的發(fā)生。
【圖文】：

5s、18s 和 28s 條帶清晰無彌散（圖1-1），提示所提取總 RNA 質(zhì)量較好，無降解現(xiàn)象，可以作為 RT-PCR 的模板。圖 1-1 所提總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig1-1 1％Agarose gel electrophresis of the total RNA2．1．2 RT-PCR 反應(yīng)在 DNA 克隆重組技術(shù)中，外源性目的基因的制備和純化是重組克隆的基礎(chǔ)。尤其是外源性基因兩端的設(shè)計牽涉到下面的將目的基因連接到質(zhì)粒載體中。本文在設(shè)計目的基因 PCR 擴增引物時，將限制性核酸內(nèi)切酶 XbaⅠ和 BglⅡ酶切位點設(shè)計入其引物的兩端，因此 PCR 反應(yīng)擴增出的 CCR7 基因片段就含有了該兩種內(nèi)切酶的堿基序列。這為下面將 CCR7 目的基因克隆重組入 pAdTrack-CMV 質(zhì)粒中提供了可供互補連接的粘性末端。經(jīng)過 PCR 反應(yīng)，得到的產(chǎn)物在 1％瓊脂糖凝膠

圖 1-2 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig1-2 Agarose gel electrophresis of the product2．1．3 目的基因膠回收純化產(chǎn)物在 DNA 克隆重組技術(shù)中，，目的基因的純化非常重要，而 RT-PCR 產(chǎn)物中不可避免地含有引物二聚體等干擾因素，故需進行膠回收純化目的基因，為下一步構(gòu)建質(zhì)粒打下基礎(chǔ)（見圖 1－3）。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R562.25

【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 應(yīng)林燕;CTLA4Ig修飾的樹突狀細胞對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

本文編號：2613903