發(fā)布時間：2017-03-21 03:06

  本文關(guān)鍵詞：香煙提取物對大鼠骨骼肌細胞MSTN及MHC表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)簡稱慢阻肺,是一種既可預防亦可治療的常見疾病,以持續(xù)存在的氣流受限為特征,氣流受限多呈進行性發(fā)展,與氣道和肺組織對有害顆�；驓怏w所致異常慢性炎癥反應有關(guān),急性加重和合并癥影響患者整體疾病的嚴重程度。據(jù)世界銀行／世界衛(wèi)生組織的資料表明,到2020年,COPD將成為世界第三大死亡原因,居世界經(jīng)濟負擔第五位。我國40歲以上人群COPD患病率為8.2%,每年致殘人數(shù)達500-1000萬,致死人數(shù)達100萬。由于COPD患病人數(shù)多,死亡率高,社會負擔重,已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。COPD系阻塞性通氣功能障礙,呼吸運動需要克服更大阻力,消耗更多能量。呼吸肌長期超負荷運動,導致骨骼肌過度做功,最終功能下降、肌無力。臨床上,終末期慢性阻塞性肺疾病患者頑固性氣促,多為呼吸肌無力,須長期使用機械輔助通氣；部分患者經(jīng)有創(chuàng)機械通氣后,呼吸機依賴,難以撤機；均給目前的治療帶來困難。另一方面,香煙對骨骼肌的損傷,導致呼吸肌無力。吸煙與慢性阻塞性肺疾病為惡性循環(huán),最終導致呼吸肌無力、頑固性氣促、呼吸衰竭、死亡。COPD既是一種以持續(xù)存在的氣流受限為特征的慢性氣道疾病,同時也是一種涉及多器官受損的全身疾病。COPD不僅累及肺臟,同時也涉及多器官受損,包括骨骼肌功能障礙(Skeletal Muscle Dysfunction, SMD)和其他系統(tǒng)功能障礙(如心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等)。過去一直認為COPD患者出現(xiàn)運動受限主要是因為肺功能受損所致,但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),在運動受限的COPD患者中,約40%患者肺功能并沒有嚴重受損,而表現(xiàn)為明顯的SMD。運動受限是COPD患者常見的臨床癥狀,也是COPD患者生活質(zhì)量下降的重要因素。COPD患者的骨骼肌功能障礙,會進一步惡化COPD患者的健康狀況,影響患者的生活質(zhì)量,尤其對中、重度COPD患者。研究表明,COPD患者常見骨骼肌無力,可早于惡病質(zhì)；晚期COPD患者骨骼肌明顯萎縮,與呼吸功能、活動耐量、健康狀態(tài)和死亡率增加有關(guān)。COPD患者SMD的發(fā)生是一個多因素、多種分子生物學機制共同參與的復雜機制,目前尚未完全明了。吸煙是罹患COPD的主要危險因素,點燃煙草可產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)導致氧化應激。呼吸系統(tǒng)不僅是氧化應激的主要靶器官,ROS可以隨著血液循環(huán)分布于全身任何臟器,而肌肉組織作為人體最大體積器官組織,同樣也是氧化應激最大的“受害者”。有證據(jù)顯示,COPD患者骨骼肌組織的氧化應激明顯增加,且這種增加與其活動能力和活動耐力呈負相關(guān)。目前肌生成抑制素(Myostatin, MSTN)的研究日益成為國內(nèi)外研究熱點。肌生成抑制素(Myostatin, MSTN)又名生長／分化因子-8(GDF-8),是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)超家族中的一員,主要作用于骨骼肌,抑制肌肉的生長發(fā)育,對骨骼肌的生長具有負調(diào)控作用,最終導致肌肉消耗和萎縮。同其他TGF-β家族成員一樣,它是以375個氨基酸的形式合成的蛋白質(zhì)。MSTN除在骨骼肌中表達外,它在分泌后可進入到血液循環(huán)中。已有研究顯示,隨著年齡增長,在體重下降和有骨骼肌消耗癥狀的老年患者,MSTN在血漿中的濃度呈增加趨勢。MSTN對骨骼肌生長的負調(diào)控作用主要通過抑制細胞周期過程,遏制成肌細胞的增殖。1873年,法國人蘭維爾(Ranuier)將骨骼肌纖維區(qū)分為紅肌和白肌,其中紅肌收縮較慢,白肌收縮較快。隨著技術(shù)的發(fā)展,1970年,利用肌球蛋白腺苷三磷酸酶(ATP_ase)反應法將哺乳動物骨骼肌分為Ⅰ、ⅡA、和ⅡB三型。隨后運用肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)單克隆抗體進行免疫組化實驗、原位雜交實驗、單個肌纖維MHC SDS-PAGE電泳和基因克隆等技術(shù),進一步將骨骼肌分型。目前常用方法系將人體骨骼肌纖維分為三型：Ⅰ型為慢收縮耐疲勞需氧型、ⅡA型為快收縮易疲勞糖酵解型、ⅡB型為快收縮耐疲勞需氧-糖酵解型。運動可以導致肌球蛋白重鏈不同亞型之間的轉(zhuǎn)變,而且是相鄰類型間的轉(zhuǎn)變。Cosker等發(fā)現(xiàn),在COPD患者中存在Ⅰ→ⅡA→ⅡB骨骼肌纖維類型之間的轉(zhuǎn)變,伴有氧化代謝能力降低；則骨骼肌纖維以ⅡB型為主,耐力、力量均下降。與同年齡的健康對照者相比,COPD患者骨骼肌力量下降,且下肢比上肢明顯,尤其股四頭肌的耐力明顯下降,抗氧化治療可以改善COPD患者的骨骼肌活動耐力,這更進一步證實了氧化應激與COPD骨骼肌功能障礙有著因果聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)COPD患者戒煙后,表現(xiàn)為體重增加,肢體周徑增長,運動耐力增加,生活質(zhì)量顯著提高,我們?nèi)粘ＥR床實踐也時常發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。故認為,除了運動能令骨骼肌纖維類型間相互轉(zhuǎn)換,推測香煙也可致骨骼肌不同肌纖維類型的轉(zhuǎn)換。綜上,吸煙是COPD重要發(fā)病原因,吸煙造成的氧化應激可造成DNA氧化損傷,并在COPD患者的SMD中起重要作用。本課題在預實驗中經(jīng)發(fā)現(xiàn)香煙煙霧(CSE)刺激的大鼠股四頭肌細胞,隨CSE濃度升高,氧化損傷程度增加,MSTN含量亦升高,提示吸煙所致的氧化損傷可能與MSTN表達升高有關(guān),但具體機制尚不清楚。另一方面,COPD患者骨骼肌纖維類型發(fā)生Ⅰ→ⅡA→ⅡB的轉(zhuǎn)變,伴有氧化代謝能力降低；且骨骼肌纖維以ⅡB型為主,耐力、力量、速度均下降。基于COPD患者存在骨骼肌消耗癥狀以及MSTN抑制骨骼肌生長的作用,香煙煙霧可造成氧化應激和MSTN基因表達增加,以及香煙煙霧可致不同骨骼肌肌纖維類型的轉(zhuǎn)換。故我們大膽地推測COPD患者SMD可能與MSTN的表達增加有關(guān),香煙煙霧刺激可增加股四頭肌MSTN的表達；故本實驗依據(jù)香煙煙霧暴露可導致COPD以及骨骼肌損傷的原理,以體外培養(yǎng)、鑒定后的SD大鼠大腿股四頭肌骨骼肌細胞作為研究靶細胞,建立不同濃度CSE刺激體外培養(yǎng)SD大鼠的大腿股四頭肌細胞損傷的模型,采用熒光定量PCR方法、蛋白免疫印跡法對肌細胞中的MSTN基因水平、蛋白水平進行檢測,同時熒光定量PCR方法檢測骨骼肌纖維類型的變化,探討CSE刺激對大鼠骨骼肌細胞表達MSTN及骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)變的影響,為進一步闡明COPD患者骨骼肌功能障礙的發(fā)病機制,并對其進行治療提供科學依據(jù)。研究目的本研究從細胞模型水平,采用分子生物學和生理學的方法,研究MSTN參與COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機制,以及骨骼肌纖維的轉(zhuǎn)換,為進一步闡明COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機制并對其進行治療提供提供新的思路及策略。再者,證實香煙對骨骼肌的毒性作用,戒煙是防治COPD/肺氣腫的重要有效措施,具有重要的臨床和社會價值。研究對象及方法1、,對象；1)體外培養(yǎng)股四頭肌細胞：選鼠齡3～5 d的SD大鼠拉頸處死,取大腿股四頭肌肌肉,去脂肪、血液、結(jié)締組織,剪碎1mm3;在體外行骨骼肌原代細胞培養(yǎng)(分別行組織塊培養(yǎng)、單層細胞培養(yǎng)),倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征；2)細胞鑒定：取第3-5代細胞分化成熟后,行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察細胞形態(tài)特征,以及細胞免疫熒光鑒定；明確貼壁細胞為骨骼肌細胞。2、方法：1)實驗分組：取第10代以內(nèi)細胞,當細胞覆蓋50%培養(yǎng)瓶時,分別加入含有0%、2.5%、5%、10% CSE的胎牛血清培養(yǎng)基(香煙提取物統(tǒng)一為使用前30分鐘制備),放置培養(yǎng)箱48小時后；隨機分四組：正常對照組、2.5% CSE組、5.0%CSE組、10.0%CSE組。2)基因水平檢測：分別提取四組細胞的RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,實時定量PCR檢測MSTN mRNA、MHC-Ⅰ mRNA、MHC-ⅡA mRNA、MHC-ⅡB mRNA的表達。3)蛋白水平檢測：分別提取四組細胞的蛋白,煮沸變性,電泳、電轉(zhuǎn),Western blotting檢測MSTN蛋白的表達。4)統(tǒng)計學方法：計量資料以(X±s)表示,多組間比較采用單因素one-way ANOVA方差分析檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果(1) 體外成功原代培養(yǎng)SD大鼠骨骼肌細胞：SD大鼠骨骼肌細胞在倒置顯微鏡下觀察可見,骨骼肌細胞剛鋪板于胎牛血清培養(yǎng)基時細胞呈圓形,形態(tài)均一,折光性強,懸浮于培養(yǎng)基中；5-6 h后開始貼壁,24 h后完全貼壁,并開始增生,細胞逐漸延伸成梭形,相互融合,按一定方向有序排列。隨細胞密度的增加,細胞逐漸有規(guī)律地平行排列；培養(yǎng)至2～3 d時細胞分化達到高峰,隨后逐漸開始凋亡、漂浮。HE染色可見細胞核呈扁橢圓形,染成藍色,符合骨骼肌細胞的形態(tài)學特點；細胞免疫熒光檢查提示90%以上的細胞呈陽性反應,細胞核染成藍色,符合骨骼肌細胞的表型特征。(2) MSTN mRNA實時定量PCR檢測結(jié)果顯示：4組MSTN mRNA相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；其中,5.0%組、10.0%組MSTN mRNA相對表達量高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；伴隨CSE的濃度升高,目標基因表達越高。支持當初的實驗設想,MSTN隨CSE的濃度升高,表達越高,(P0.05)。(3) MHC-Ⅰ mRNA實時定量PCR檢測結(jié)果顯示：4組MHC-Ⅰ mRNA相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；其中,5.0%組、10.0%組MHC-Ⅰ mRNA相對表達量低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；伴隨CSE的濃度升高,目標基因表達越低。支持當初的實驗設想,MHC-Ⅰ隨CSE的濃度升高,表達越低,(P0.05)。(4) MHC-ⅡA mRNA實時定量PCR檢測結(jié)果顯示：4組MHC-ⅡA mRNA相對表達量比較,其中,2.5%組、5.0%組、10.0%組MHC-ⅡA mRNA相對表達量低于對照組,只有2.5%組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而5.0%組、10.0%組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(5) MHC-ⅡBmRNA實時定量PCR檢測結(jié)果顯示：經(jīng)3次更換MHC-ⅡB的引物,反復實驗,均未能作出擴增曲線及溶解曲線。(6) MSTN蛋白Western blotting檢測結(jié)果顯示：4組MSTN蛋白表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；其中,5.0%組、10.0%組MSTN蛋白表達水平高于對照組和2.5%組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；伴隨CSE的濃度升高,目標蛋白表達越高。支持當初的實驗設想,MSTN隨CSE的濃度升高,表達越高,(P0.05)。結(jié)論1、香煙提取物可致體外骨骼肌細胞變形、凋亡,濃度越高、刺激時間越長,表現(xiàn)越明顯。2、香煙提取物刺激骨骼肌細胞內(nèi)肌肉生長抑制素的mRNA基因及蛋白水平升高,其水平隨CSE濃度的升高而升高,提示吸煙可導致骨骼肌功能障礙、萎縮。3、香煙提取物刺激骨骼肌細胞后,MHC-Ⅰ、MHC-ⅡAmRNA基因表達水平下降,吸煙可導致MHC-Ⅰ與MHC-Ⅱ型骨骼肌纖維減少。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 肌肉生長抑制素 慢性阻塞性肺疾病 骨骼肌細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-29
• 第二章 研究對象和方法29-52
• 2.1 第一節(jié) 實驗對象和分組29
• 2.2 第二節(jié) 儀器設備及相關(guān)試劑29-33
• 2.3 第三節(jié) 研究方法33-52
• 2.3.1 第一小節(jié) 原代細胞培養(yǎng)33-35
• 2.3.2 第二小節(jié) 骨骼肌細胞蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫熒光鑒定35-37
• 2.3.3 第三小節(jié) 香煙提取物的制作和濃度的選擇37-39
• 2.3.4 第四小節(jié) 實時定量PCR檢測MSTN mRNA的表達39-43
• 2.3.5 第五小節(jié) 實時定量PCR檢測MHC-Ⅰ mRNA的表達43-44
• 2.3.6 第六小節(jié) 實時定量PCR檢測MHC-ⅡA mRNA的表達44
• 2.3.7 第七小節(jié) 實時定量PCR檢測MHC-ⅡB mRNA的表達44-45
• 2.3.8 第八小節(jié) Western blotting檢測MSTN蛋白的表達45-51
• 2.3.9 第九小節(jié) 統(tǒng)計學方法51-52
• 第三章 實驗結(jié)果52-67
• 3.1 第一節(jié) 原代細胞培養(yǎng)結(jié)果52-53
• 3.2 第二節(jié) 骨骼肌細胞蘇木素-伊紅(H E)染色結(jié)果53-54
• 3.3 第三節(jié) 骨骼肌細胞免疫熒光鑒定結(jié)果54-55
• 3.4 第四節(jié) 實時定量PCR檢測MSTN mRNA的表達的結(jié)果55-58
• 3.4.1 MSTN、GAPDH的擴增曲線及溶解曲線55-56
• 3.4.2 統(tǒng)計結(jié)果56-58
• 3.5 第五節(jié) 實時定量PCR檢測MHC-ⅠmRNA的表達的結(jié)果58-60
• 3.5.1 MHC-Ⅰ、GAPDH的擴增曲線及溶解曲線58
• 3.5.2 統(tǒng)計結(jié)果58-60
• 3.6 第六節(jié) 實時定量PCR檢測MHC-ⅡA mRNA的表達的結(jié)果60-63
• 3.6.1 MHC-ⅡA、GAPDH的擴增曲線及溶解曲線60-61
• 3.6.2 統(tǒng)計結(jié)果61-63
• 3.7 第七節(jié) Western blotting檢測MSTN蛋白的表達結(jié)果63-67
• 3.7.1 考馬斯亮藍染色63-64
• 3.7.2 麗春紅染色64-65
• 3.7.3 Western blotting檢測統(tǒng)計結(jié)果65-67
• 第四章 討論67-71
• 第五章 結(jié)論71-72
• 參考文獻72-78
• 中英文對照表78-79
• 攻讀學位期間成果79-80
• 工作研究經(jīng)歷80-81
• 致謝81-82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊天蕓;徐衛(wèi)國;羅勇;韓鋒鋒;陳迎春;管雯斌;;慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨骼肌功能失調(diào)的原因分析[J];上海醫(yī)學;2008年07期

  本文關(guān)鍵詞：香煙提取物對大鼠骨骼肌細胞MSTN及MHC表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：258912