【摘要】：研究背景：結核病(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染病。結核病疫情下降緩慢,肺結核(pulmonary tuberculosis, PTB)仍是影響全球特別是發(fā)展中國家公共衛(wèi)生的重大傳染疾病,急需新的策略提高肺結核的早期診斷質量。生物標志物對于疾病的篩查、診斷、預后、療效判斷以及檢測十分重要,因此,尋找更為靈敏的特征性的生物標志物是早期診斷肺結核的當務之急。蛋白組學技術的發(fā)展為從整體水平分析血清蛋白質提供了技術平臺,表面加強激光解析電離飛行時間質譜(surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)結合基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)、線性液質聯(lián)用離子解串聯(lián)質譜技術(linear ion chromatograph mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)技術,作為全新的蛋白組學技術可實現(xiàn)對血清中特異性標志物的篩選和鑒定。 研究方法：采用弱陽離子(weak cation exchange, WCX)磁珠結合SELDI-TOFMS技術建立180例初治繼發(fā)性肺結核患者和211例對照的血清蛋白指紋圖譜,應用Biomarker Pattern Software (BPS)軟件建立肺結核的診斷模型。通過反相高效液相色譜(reverse phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)分離及純化潛在的生物標志物蛋白,應用MALDI-TOF MS跟蹤目標蛋白,進一步用線性液質聯(lián)用離子肼串聯(lián)質譜(linear ion chromatograph mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)進行分析,以鑒定潛在診斷標志物蛋白,并用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進行驗證。 研究結果：120例肺結核和120例非肺結核(60例健康對照、20例肺癌、20例肺炎、20例慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD))血清蛋白圖譜比較,35個蛋白峰在肺結核和非肺結核組之間有顯著差異(P0.01,Fold≥1.5)。篩選2554.6,4824.4,5325.7和8606.8m/z四個蛋白峰構建了診斷模型Ⅰ,靈敏度為83.3%,特異度為84.2%,該模型顯示在肺結核臨床大規(guī)模的篩查具有較好的診斷能力,盲法檢驗靈敏度為75.0%,特異度為83.5%。以120例肺結核患者和60例肺結核其他疾病(肺癌、肺炎、COPD)篩選的差異峰為基礎構建了由4180.1,5325.7,15103.6m/z3個蛋白峰組成的診斷模型Ⅱ,靈敏度為87.5%,特異度為90.0%。該模型在臨床上對于有相似癥狀以及相似影像學改變的肺結核和其他肺部疾病的鑒別具有更強的應用性,該模型盲法靈敏度為81.7%,特異度為85.0%,陽性預測值為84.5%。在肺結核中相對高表達的2554.6m/z蛋白峰經(jīng)RP-HPLC分離純化,并利用MALDI-TOF MS及LC-MS/MS進行鑒定,為纖維蛋白原(fibrinogen, alpha polypeptide isoform alpha-E preproprotein)的一個片段。血清ELISA實驗結果證實肺結核組的纖維蛋白原降解產(chǎn)物(fibrinogen degradation product, FDP)量均值高于健康對照組(5,005±1,297vs.4,010±1,181ng/mL,P＜0.05),142例臨床隨機收集的肺結核病人血漿中的纖維蛋白原含量(5.45±1.65g/L)要高于正常值范圍(2.0-4.0g/L)。 結論：(1)建立納米磁珠結合SELDI-TOF MS的肺結核蛋白指紋圖譜檢測技術,可快速穩(wěn)定靈敏地構建肺結核蛋白指紋圖譜；建立了RP-HPLC聯(lián)合MALDI-TOF MS、LC-MS/MS鑒定SELDI-TOF MS特異差異峰技術。(2)篩選了肺結核相關的差異蛋白峰,構建了肺結核早期診斷的蛋白診斷模型,為建立肺結核病臨床早期快速特異診斷的血清蛋白質組學標準,提高肺結核病的防治水平奠定基礎。(3)鑒定和驗證了纖維蛋白原可能為肺結核早期診斷的潛在生物標志物之一,為臨床肺結核早期診斷奠定了基礎。 研究背景：肺結核屬于中醫(yī)學“肺癆”范疇,目前用于肺結核治療的化學藥物雖有療效但毒副作用大且易形成耐藥性,而中醫(yī)基于患者機體正虛和癆蟲感染辨證施治,尤其是近年來中西醫(yī)結合治療在耐藥肺結核和疑難重癥肺結核治療中取得了一定的療效。證候是中醫(yī)辨證施治的核心,肺結核中醫(yī)證候的診斷尚無科學量化的標準,嚴重影響臨床治療效果。蛋白質組學技術的很多特征如整體性、動態(tài)性、時空性、復雜性等與中醫(yī)證候的特點十分吻合,以蛋白質組為切入點,深入進行證候實質的研究,有利于從微觀的角度動態(tài)地了解證候的物質基礎,可為中醫(yī)證候診斷分型的客觀化提供依據(jù)。 研究方法：采用中醫(yī)獨立四診辨證結合舌診儀脈診儀對180例肺結核患者進行辨證分型,納入肺陰虛證(FYX)71例,陰虛火旺證(YXHW)64例,氣陰兩虛證(QYLX)45例。采用WCX磁珠結合SELDI-TOF MS技術建立血清蛋白指紋圖譜,應用Biomarker Wizard軟件比較各證候間的差異峰并進行證候共性分析。應用BPS軟件建立肺結核證候的辨證模型。通過RP-HPLC分離及純化潛在的生物標志物蛋白,應用MALDI-TOF MS和LC-MS/MS進行分析,以鑒定潛在證候標志物蛋白,并用蛋白芯片技術進行驗證。 研究結果：50例FYX證、40例YXHW證、30例QYLX證血清蛋白指紋圖譜兩兩比較并作共性分析,FYX證與與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有12個(P0.001), YXHW證與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有12個(P0.001),QYLX證與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有34個(P0.001)；有7個蛋白峰在三證間的含量呈肺陰虛→陰虛火旺→氣陰兩虛逐漸降低變化。以三證候間兩兩有差異的74個差異峰(P0.001)為基礎構建了由3961.7、4679.7、5646.4、8891.2、9416.7m/z5個蛋白標志峰組成的肺結核中醫(yī)證候蛋白質指紋圖譜辨證模型,對于FYX證辨證的準確率為74.0%,對于YXHW證的準確率為72.5%,對于QYLX的準確率為96.7%。該模型對于肺結核三證候的分型具有較好的鑒別能力,盲法驗證對于FYX證辨證的準確率為76.2%,對于YXHW證的準確率為70.8%,對于QYLX的準確率為80.0%。對篩選到的蛋白差異峰進行了鑒定和抗體芯片的驗證,結果表明9416.7m/z蛋白峰是apolipoprotein C-Ⅲ載脂蛋白C-Ⅲ中的一段多肽。 結論：(1)篩選歸納了肺結核各證候特有的差異蛋白峰,可能是證候外在表現(xiàn)的內在病理機制和物質基礎,為整體性評價肺結核中醫(yī)證候的實質提供證據(jù)；歸納了7個蛋白峰在三證間的含量呈肺陰虛→陰虛火旺→氣陰兩虛逐漸降低變化,結果與中醫(yī)理論關于肺結核證候病情演變相契合,差異的標志蛋白峰體現(xiàn)了肺結核證候間一定的相互關系及演變規(guī)律。(2)構建了肺結核中醫(yī)證候蛋白辨證模型,為肺結核證候診斷的客觀化提供蛋白質標準,有助于規(guī)范肺結核中醫(yī)治療的辨證施治。(3)鑒定和驗證了載脂蛋白C-Ⅲ在肺結核三證候中差異表達,可能為肺結核中醫(yī)證候分型的血清潛在標志物之一,可在臨床和功能方面作進一步的驗證。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R521;Q51

【參考文獻】

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本文編號：2531023