【摘要】：一.研究背景 支氣管哮喘(bronchial asthma,簡稱哮喘)是全球最常見的慢性疾病之一,它是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,病理鏡下可見支氣管周圍和肺泡間隔有中性粒細胞、漿細胞、單核細胞和大量嗜酸粒細胞浸潤,慢性氣道炎癥被認為是哮喘的本質(zhì)。支氣管哮喘的氣道炎癥使人體對各種激發(fā)因子的反應(yīng)性增高,產(chǎn)生氣道縮窄和可逆性氣流受限,出現(xiàn)咳嗽,氣急和喘息等癥狀,嚴(yán)重地影響著患者的工作和生活,因此,減輕氣道炎癥及減少細胞浸潤成為治療哮喘的重要措施。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid, GC)是目前抑制哮喘氣道炎癥作用最強的藥物,因為它對炎癥介質(zhì)、炎癥細胞和炎癥反應(yīng)具有多途徑的抑制作用。然而,關(guān)于哮喘炎細胞浸潤的機制尚不明確,因此探討哮喘細胞浸潤的發(fā)病機制、尋找新的治療及藥物靶點是備受關(guān)注的重大課題。 隨著研究的不斷發(fā)展,關(guān)于哮喘發(fā)病的假說不斷增多,現(xiàn)在有越來越多的證據(jù)表明菌群失調(diào)與過敏或哮喘有密切聯(lián)系。許多流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肥胖與哮喘的發(fā)生發(fā)展有重大關(guān)系。在既往一項流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),發(fā)展為哮喘的兒童與正常兒童在過去的飲食攝入完全不同。哮喘組的兒童較對照組攝入更多肉類,膳食纖維攝入減少,兩組兒童體重具有統(tǒng)計學(xué)差異。膳食纖維對機體的免疫調(diào)節(jié)相當(dāng)重要,它在腸道厭氧菌的發(fā)酵作用下生成短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs), SCFAs主要包括乙酸、丙酸、丁酸。這些脂肪酸除了用于提供人體5-10%的能量需求外,還對腸道免疫功能的調(diào)節(jié)起到重要作用,而這種調(diào)節(jié)作用是通過表達在免疫細胞膜表面的GPR43(G protein-coupled receptor43)受體介導(dǎo)的。 G蛋白偶聯(lián)受體(GPRs)是一種與三聚體G蛋白偶聯(lián)的細胞表面受體,又稱7α螺旋跨膜蛋白受體,在介導(dǎo)細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著十分重要的調(diào)控作用。GPR43受體(G protein-coupled receptor43)是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員,最初在尋找新的甘丙肽(Galanin)受體亞型時克隆獲得,其編碼基因定位于人類第19號染色體19q13.1,與GPR40、GPR41和GPR42串聯(lián)排列于CD22基因的下游。由于其以SCFAs為特異性受體,故又名為游離脂肪酸受體2(Free fatty acids receptor2, FFAR2)。由于該受體在人類多種組織包括免疫細胞、腸道、脂肪、肺組織等表達,因此具有多種生物學(xué)功能,參與了免疫細胞分化遷移、脂質(zhì)代謝及粘膜免疫等過程,證實與炎癥性腸炎、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、腫瘤等疾病密切相關(guān)。在GPR43-/-的類風(fēng)關(guān)、哮喘、炎癥性腸炎的小鼠模型上發(fā)現(xiàn)炎癥均加重,證明了SCFAs通過表達GPR43受體的細胞起到抗炎效果。該受體在白細胞前體分化為各種粒細胞時大量表達,提示GPR43受體在白細胞激活和分化過程中具有重要作用,Vinolo MA用SCFAs體外誘發(fā)粒細胞定向遷移(趨化),也是依賴于GPR43受體的激活。經(jīng)腸道吸收入血的短鏈脂肪酸與免疫細胞表面的GPR43受體結(jié)合,激活MAPK/P38、PLC和ATF-2基因等胞內(nèi)途徑,使胞內(nèi)信號Ca2+增加,從而產(chǎn)生各種趨化因子及ROS產(chǎn)物,進而誘發(fā)外周血免疫細胞遷移至炎癥部位,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。Maslowski K M等用OVA致敏敲除了GPR43基因的小鼠,最后發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠表現(xiàn)的氣道炎癥比野生型小鼠要嚴(yán)重,細胞浸潤數(shù)明顯增加,研究者認為這是因為缺乏GPR43受體的免疫細胞對各種化學(xué)引誘物如C5a和炎癥趨勢因子高度敏感(更容易引起過敏反應(yīng))所致。其次,Cox MA在研究中證實SCFAs能通過GPR43受體誘導(dǎo)單核細胞釋放前列腺素E2(prostagland E2, PGE2),目前研究表明PGE2能保護下氣道的收縮作用。 慢性炎癥及炎細胞浸潤是哮喘重要的病理生理特點,而免疫細胞膜上的GPR43受體與炎癥細胞的遷移和免疫調(diào)節(jié)功能息息相關(guān),因此推測GPR43受體可能參與了哮喘的病生過程,但目前關(guān)于支氣管哮喘與GPR43受體表達間的關(guān)系研究鮮有報導(dǎo)。本研究在建立哮喘小鼠模型的基礎(chǔ)上觀察GPR43受體在肺組織的表達,探討GPR43受體在哮喘氣道炎癥細胞浸潤中的作用,進一步使用GC治療哮喘小鼠,觀察GC對該受體的表達調(diào)節(jié)。 二.研究目的 研究GPR43受體在小鼠肺組織內(nèi)的表達,比較對照組及哮喘組GPR43受體的表達有否差異性,同時探討地塞米松對該受體表達的影響。 三.研究方法 1.建立哮喘模型 根據(jù)參考文獻,30只BALB/C6小鼠隨機分為對照組(A組)、哮喘組(B組)、地塞米松組(C組),每組10只,用卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)和氫氧化鋁[Al (OH)3]混合制劑進行腹腔注射致敏、OVA霧化吸入激發(fā)的方法制備小鼠哮喘模型。于第0天和第14天每只小鼠腹腔注射0.2ml致敏液含40μg OVA和10mgAl (OH)3,第21天開始,霧化吸入5%的OVA40min,每周3次,為期8周。對照組以生理鹽水代替致敏液。地塞米松組在每次霧化前30min腹腔注射2mg/ml濃度的地塞米松,對照組以同等劑量生理鹽水代替地塞米松進行腹腔注射。 2.標(biāo)本采集和處理 末次霧化24h后斷頸處死小鼠,打開胸腔,結(jié)扎右側(cè)支氣管,用0.9%冰浴生理鹽水0.3ml行支氣管肺泡灌洗,回收灌洗液。將BALF離心并取上清,沉淀物涂片染色,顯微鏡下按細胞形態(tài)作細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞分類計數(shù)。右肺切除后立即投入液氮罐,留待提取RNA。左肺用針頭灌注4%多聚甲醛液,然后切除置于4%多聚甲醛液中固定,24h后肺組織行石蠟包埋切片。 3.評估哮喘模型建立效果 肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù),HE染色觀察各組氣道炎癥發(fā)生及氣道結(jié)構(gòu)改變情況,計算單位長度基底膜的氣道管壁面積(WAt/Pbm)評估造模效果。 4.檢測GPR43受體mRNA及蛋白在小鼠肺組織中的表達和觀察GPR43受體在肺氣道上皮及上皮下的分布情況 RT-PCR測定各組小鼠肺組織GPR43受體mRNA的表達變化,免疫組化觀察肺中GPR43受體的表達及定位,通過Western blot技術(shù)檢測小鼠肺組織中FPR43蛋白的表達。 5.統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA), Levene法進行方差齊性檢驗,方差齊時組間兩兩比較用LSD法,方差不齊的計量數(shù)據(jù)采用校正的F檢驗(Welch法),并選用Dunnet T3法做多重比較。P0.05認為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。 四.結(jié)果 1.兩組小鼠的總體外觀 哮喘模型組：霧化吸入OVA后小鼠表現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、鼻翼煽動、腹肌抽搐、大小便失禁等癥狀,嚴(yán)重者出現(xiàn)四肢癱軟、毛色失去光澤。正常對照組：霧化吸入OVA后小鼠活動如常、呼吸平穩(wěn)、毛發(fā)順澤,無煩躁不安、呼吸急促等表現(xiàn)。地塞米松組：霧化吸入OVA后小鼠頻繁撓嘴、活動量增加,但程度較哮喘組輕。 2.小鼠氣道炎癥的評估 BALF計數(shù)可見哮喘組細胞總數(shù)(26.765±1.929)、嗜酸性粒細胞計數(shù)(4.686±0.463)、嗜酸性粒細胞(17.039±1.148)、淋巴細胞(30.436±1.775)及巨噬細胞分類計數(shù)(43.454±4.521)均升高,與對照組(13.556±1.210、0.081±0.006、0.248±0.092、11.283±1.399、83.712±4.390)、地塞米松組(18.433±0.625、1.091±0.109、4.746±0.516、20.529±1.551、55.137±3.412)有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。肺組織切片染色：哮喘模型組小鼠氣道管腔痙攣,上皮細胞增生脫落,氣道粘液分泌增加,氣道及血管周圍浸潤大量炎性細胞,以嗜酸性粒細胞為主,肺間質(zhì)及肺泡腔也可見嗜酸性粒細胞存在。正常對照組小鼠氣道上皮完整,氣道及血管周圍僅見極少量炎性細胞。地塞米松組小鼠支氣管黏膜上皮、黏膜肌層結(jié)構(gòu)較完整,支氣管腔規(guī)則,部分仍有輕微破壞,支氣管黏膜下EOS明顯減少。HE染色圖像分析結(jié)果表明,哮喘組(18.35±1.00)小鼠WAt/Pbm值較對照組(9.31±0.46)明顯增高,兩組比較差異有顯著性(P0.01),地塞米松組(12.34±2.13)上述指標(biāo)較哮喘組明顯下降,差異有顯著性(P0.01),地塞米松組與對照組相比WAt/Pbm值增高,(P0.05)。 3.GPR43受體在各組小鼠肺組織中的表達及意義 RT-PCR分析表明哮喘組GPR43受體mRNA表達量(0.512±0.067)較對照組(1.031±0.266)、地塞米松組(0.759±0.046)明顯降低,差異有顯著性(P0.01),地塞米松組與對照組相比上述指標(biāo)下降(P0.05)。免疫組化圖像分析結(jié)果顯示GPR43受體在小鼠肺組織的氣道上皮、上皮下粘膜組織、血管內(nèi)皮均有表達,哮喘組大量炎癥細胞(包括嗜酸性粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞、巨噬細胞)皆有表達。哮喘組表達強度(1.375±0.115)均明顯弱于對照組(2.109±0.135)、地塞米松組(1.78±0.070)(P0.01),地塞米松組與對照組相比上述指標(biāo)下降(P0.05)。免疫印跡結(jié)果提示哮喘組小鼠肺組織GPR43受體的表達水平(0.24±0.06)要明顯低于對照組(1.28±0.09)小鼠(P0.01),地塞米松組蛋白水平(0.77±0.09)較哮喘組明顯提高(P0.01),但仍低于對照組(P0.01)。 五.結(jié)論 1.GPR43受體在小鼠肺組織廣泛分布,包括氣道上皮、上皮下浸潤的炎性細胞、血管內(nèi)皮及肺泡上皮組織,GPR43受體與氣道疾病有一定相關(guān)性。 2.哮喘組GPR43表達顯著低于對照組,表明GPR43受體表達減少參與哮喘的病理生理過程。給予地塞米松治療后GPR43較哮喘組表達量顯著回升,表明地塞米松可能恢復(fù)GPR43的表達,證明哮喘的形成與免疫細胞及肺組織GPR43的表達減少有關(guān),同時也提示了地塞米松對GPR43參與的代謝性疾病或許存在某些相關(guān)性。 3.哮喘模型組的小鼠肺組織中GPR43受體的表達明顯減弱,且主要表達于哮喘小鼠肺組織浸潤的炎性細胞、氣道上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞,這些細胞可能是GPR43途徑作用于哮喘的主要靶細胞。 4.哮喘組小鼠肺組織GPR43的表達顯著低于對照組,表明哮喘和GPR43參與的代謝性疾病或許存在某些相關(guān)性,例如肥胖、飲食結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)狀態(tài)及抗生素的使用與哮喘或許呈相關(guān)性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25

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本文編號：2418299