發(fā)布時間：2019-01-19 18:30

【摘要】：急性肺損傷(acute lung injure ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratory distress syndrome ARDS)是臨床上危重病人嚴重的并發(fā)癥和重要的死亡原因，其相關(guān)的死亡率仍高達40%，治療效果差，與其發(fā)病機制復(fù)雜有關(guān)。急性肺損傷的病理基礎(chǔ)包括有過度、持續(xù)的肺泡炎癥伴有肺泡上皮細胞受損甚至死亡。肺泡上皮細胞(Alveolar epithelial cellsAECs)是致病原攻擊的首要靶細胞，也是炎癥活化細胞和效應(yīng)細胞，能被LPS激活，釋放IL-8, IL-6, TNF-α, ICAM-1等炎癥介質(zhì)，進而引起細胞的結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙和凋亡、壞死等改變，A549細胞廣泛應(yīng)用于肺泡上皮細胞的損傷-保護機制研究中。 2008年三個獨立的研究小組分別采用不同的實驗研究和理論預(yù)測的策略，驗證TMEM16A可能為CaCC的分子基礎(chǔ)，CaCCs屬于陰離子通道，在不同的組織器官起著各種各樣的作用，在體和體外試驗均證實TMEM16A是鈣離子依賴性氯離子分泌所必須的。TMEM16A高表達能夠抑制囊性纖維化患者氣道上皮細胞分泌炎癥因子IL-8。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A表達于大鼠正常肺泡上皮細胞，大腸桿菌氣道注入復(fù)制的急性肺損傷大鼠模型肺組織內(nèi)TMEM16A蛋白較正常大鼠的表達水平減低，推測TMEM16A在急性肺損傷中起作用。人Ⅱ型上皮細胞是否表達TMEM16A，在LPS誘導(dǎo)的急性肺泡上皮損傷中TMEM16A表達有何變化，TMEM16A對急性肺損傷中肺泡上皮細胞分泌炎性因子、凋亡的影響是我們在試驗中擬解決的問題。本課題以肺泡Ⅱ型上皮細胞A549為研究對象，以分子生物學(xué)及細胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)為手段，系統(tǒng)研究了以下幾方面內(nèi)容：（1）LPS刺激誘導(dǎo)急性上皮損傷模型的建立。觀察TMEM16A蛋白在A549中的表達及LPS刺激對TMEM16A表達的影響。（2）穩(wěn)定表達TMEM16A蛋白的A549細胞株的建立及其鑒定。（3）過表達TMEM16A對LPS誘導(dǎo)A549細胞分泌炎性因子及細胞凋亡的作用。（4）siRNA干擾TMEM16A對LPS誘導(dǎo)A549細胞分泌炎性因子的作用。論文具體內(nèi)容如下： 第一部分脂多糖刺激下TMEM16A在人Ⅱ型肺泡上皮細胞中表達的調(diào)控 目的：復(fù)制LPS誘導(dǎo)肺泡上皮急性損傷模型，觀察在Ⅱ型肺泡上皮細胞急性損傷時TMEM16A的變化，驗證TMEM16A是否表達于人Ⅱ型肺泡上皮細胞，是否參與了急性肺損傷過程。 方法：以LPS刺激A549細胞，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液TNF-α水平，用Annexin V-FITC/PI雙染細胞經(jīng)FCM測細胞的凋亡情況，透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)變化，以此驗證LPS誘導(dǎo)肺泡上皮急性損傷模型復(fù)制成功。加入LPS前和加入刺激后6h、12h、24h、36h、48h分別收集細胞，提取蛋白，定量，用western blots法測定指定時間點TMEM16A蛋白表達。 結(jié)果： 1LPS刺激可誘導(dǎo)急性肺泡上皮損傷。⑴LPS刺激前及刺激后3，6，12，24h共五個時相點TNF-α水平有統(tǒng)計學(xué)差異，與未受刺激的A549細胞相比，LPS刺激的A549細胞的TNF-α水平于刺激后3，6，12，24h四個時相點顯著升高，并以6h上調(diào)水平最高。⑵透射電鏡觀察：LPS刺激的A549細胞表面的微絨毛減少，細胞內(nèi)可見大量的空泡，線粒體部分嵴和少部分膜融合，模糊不清，可見嵴缺失。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，可見顆粒融合及脫顆�，F(xiàn)象。⑶LPS刺激24小時后早期凋亡和晚期凋亡、壞死明顯增加。 2A549細胞表達有TMEM16A蛋白，LPS刺激后6小時，12小時TMEM16A的表達量與加刺激前組相比無差異，LPS刺激后24小時、36小時TMEM16A的表達量明顯增高，與加刺激前組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。LPS刺激后48小時TMEM16A的表達量明顯減低，與加刺激前組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。 結(jié)論：脂多糖可誘導(dǎo)A549細胞活化，分泌TNF-α，誘導(dǎo)其早期、晚期凋亡，加劇細胞損傷，成功建立了脂多糖誘導(dǎo)的急性肺泡上皮損傷模型，并發(fā)現(xiàn)TMEM16A在Ⅱ型肺泡上皮細胞中有表達，并且在脂多糖誘導(dǎo)下TMEM16A蛋白表達水平有動態(tài)改變，提示TMEM16A參與了急性肺泡上皮損傷過程。 第二部分TMEM16A高表達抑制脂多糖誘導(dǎo)A549分泌炎性因子及凋亡 目的：建立TMEM16A穩(wěn)定高表達的A549細胞株，研究TMEM16A過表達對LPS誘導(dǎo)A549急性損傷時炎性因子的分泌及細胞凋亡的影響。 方法：將TMEM16A-pCMV6-Kan/Neo重組質(zhì)粒擴增后，堿裂解法抽提，獲得較多量的質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體2000，將TMEM16A基因轉(zhuǎn)至A549細胞，經(jīng)G418篩選，SX克隆化，并經(jīng)實時定量PCR，免疫印跡驗證建立TMEM16A穩(wěn)定高表達的細胞株。采用ELASA方法測定不同處理組分泌的炎癥因子TNF-α、IL-8水平。采用AnnexinV-FITC/Pl雙染法應(yīng)用流式細胞分析儀檢測不同處理組間的細胞凋亡率的情況。 結(jié)果： 1pCMV-TMEM16A經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染至A549細胞，再經(jīng)G418篩選，SX克隆化，實時定量PCR顯示：未處理的A549組、pCMV6空載體陰性對照組和pCMV6-TMEM16轉(zhuǎn)染組三組間相對mRNA水平有顯著性差異，其中pCMV6-TMEM16A轉(zhuǎn)染組明顯高于未處理的A549組及pCMV6空載體陰性對照組。而未處理的A549組及pCMV6空載體陰性對照組兩組間無顯著性差異。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，pCMV-TMEM16AA549細胞在114KD左右能檢測到明顯的蛋白條帶，而A549及pCMV6空載體陰性對照組僅見少量內(nèi)源性TMEM16A蛋白表達，定量分析顯示：三組間TMEM16A蛋白表達水平有顯著性差異，其中pCMV6-TMEM16A轉(zhuǎn)染組明顯高于未處理的A549組及pCMV6空載體陰性對照組，而A549組及pCMV6空載體陰性對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異，提示外源性TMEM16A基因已整合入A549細胞并穩(wěn)定表達蛋白，成功建立了TMEM16A穩(wěn)定高表達的A549細胞株。 2無LPS刺激時，上述三組細胞在各個時相TNF-α，IL-8水平無統(tǒng)計學(xué)差異，在LPS刺激下三組TNF-α，IL-8水平在多個時相均顯著增高，但TMEM16A的高表達組與其它兩組相比，在相同時相TNF-α,IL-8水平顯著降低。即TMEM16A高表達能明顯下調(diào)但不能完全阻斷LPS誘導(dǎo)的A549細胞分泌TNF-α、IL-8的作用。 3在無LPS刺激時，A549細胞、pCMV空載體轉(zhuǎn)染的A549細胞與TMEM16A穩(wěn)定高表達的A549細胞相比三組間細胞早期、晚期/壞死凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異。說明在無LPS刺激時TMEM16A高表達不影響細胞的凋亡。三組細胞在LPS刺激24小時后與刺激前相比，細胞的早期、晚期凋亡/壞死率均顯著增高，即LPS作用于上述三組細胞24小時均可使其早期、晚期/壞死凋亡率凋亡率明顯增加。在LPS刺激24小時后，三組間的早期凋亡有統(tǒng)計學(xué)差異，其中A549細胞與pCMV空載體轉(zhuǎn)染的A549細胞的早期凋亡無統(tǒng)計學(xué)差異，而TMEM16A高表達的A549細胞組比A549細胞組、pCMV空載體轉(zhuǎn)染的A549細胞的細胞早期凋亡率降低。在LPS刺激24小時后，三組間的晚期凋亡及壞死率間無統(tǒng)計學(xué)差異。說明pCMV空載體轉(zhuǎn)染不影響LPS誘導(dǎo)的A549細胞凋亡的改變，TMEM16A的高表達卻可明顯的減低LPS誘導(dǎo)的細胞早期凋亡。文中以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：成功建立了TMEM16A穩(wěn)定高表達的A549細胞株，TMEM16A高表達可明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)肺泡上皮細胞活化分泌炎性因子及細胞早期凋亡。 第三部分慢病毒介導(dǎo)RNAi敲除TMEM16A對脂多糖誘導(dǎo)的A549分泌炎性因子的作用 目的:慢病毒表達載體介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)人肺泡Ⅱ型上皮株A549細胞TMEM16A表達，研究TMEM16A基因敲除對LPS誘導(dǎo)A549急性損傷時炎性因子的分泌的影響。 方法:委托上海吉凱基因公司，設(shè)計并制備出4條針對TMEM16A基因的RNAi序列及1條陰性對照序列，分別與GV115-GFP載體連接，構(gòu)建5個重組慢病毒表達載體TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#， TMEM16A-RNAi-LV3#， TMEM16A-RNAi-LV4#和Screamble-RNAi；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選陽性克隆、測序鑒定。將重組慢病毒載體、pHelper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒并測定病毒滴度。將包裝產(chǎn)生的5種重組慢病毒分別感染A549細胞，熒光顯微鏡下了解感染效率，并經(jīng)western blots檢測顯示TMEM16A-RNAi-LV3#消減TMEM16A的效率最高，故選用TMEM16A-RNAi-LV3#進行后續(xù)試驗，下文中TMEM16A-RNAi-LV即指TMEM16A-RNAi-LV3#，實時定量PCR和免疫印跡檢測TMEM16A-RNAi-LV感染的A549細胞TMEM16A mRNA和蛋白的表達，并與未感染的A549細胞及Scr-RNAi-LV感染細胞進行比較。采用ELISA法測定非感染A549細胞組(A549)，Scr-RNAi-LV感染組（RNA干擾陰性對照組RNC），TMEM16A-RNAi-LV感染組(TMEM16A基因敲減組KD)收集的細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-8水平并做比較。 結(jié)果: 1熒光顯微鏡顯示重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549細胞72小時后，TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#，TMEM16A-RNAi-LV3#感染組均表達綠色熒光蛋白，表示成功轉(zhuǎn)入了A549細胞，而TMEM16A-RNAi-LV4#感染組未見熒光，提示未能成功轉(zhuǎn)入了A549細胞。 2對TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#，TMEM16A-RNAi-LV3#感染的A549行western blot檢驗，發(fā)現(xiàn)TMEM16A-RNAi-LV3#對TMEM16A蛋白表達的抑制明顯，，所以選用TMEM16A-RNAi-LV3#進行下步試驗。 3將TMEM16A-RNAi-LV、Scr-RNAi-LV感染A549細胞，并與未感染的A549細胞相比較發(fā)現(xiàn)TMEM16A-RNAi-LV感染組TMEM16A基因mRNA和蛋白的表達量與未感染慢病毒的細胞組及空載體感染組相比均明顯下降(P0.05)。 4無LPS刺激時，上述三組細胞在各個時相TNF-α，IL-8水平無統(tǒng)計學(xué)差異，說明TMEM16A基因消減不影響Ⅱ型上皮細胞分泌TNF-α，IL-8。在LPS刺激下三組TNF-α，IL-8水平在多個時相均顯著增高，并且TMEM16A消減組與其它兩組相比，在相同時相TNF-α,IL-8水平顯著增高，說明TMEM16A的消減明顯加強了TNF-α、IL-8分泌，即TMEM16A的消減能明顯促進LPS誘導(dǎo)的A549細胞TNF-α、IL-8分泌的作用。 結(jié)論:成功構(gòu)建并經(jīng)篩靶找出了針對TMEM16A基因的慢病毒載體TMEM16A-RNAi-LV,體外感染A549細胞后可有效抑制TMEM16A基因和蛋白的表達。TMEM16A的消減能明顯促進LPS誘導(dǎo)的A549細胞TNF-α、IL-8的分泌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563.8

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本文編號：2411632