【摘要】：目的:探討大氣細顆粒物PM2.5水溶成分(water soluble PM2.5 extracts,WSPE)在體外模型中對HBE細胞的毒性效應(yīng),通過氧化應(yīng)激激活p53-Noxa通路誘導細胞凋亡,探索WSPE暴露的可能細胞毒性機制及發(fā)病機制,為進一步認識河南地區(qū)大氣PM2.5對呼吸系統(tǒng)危害的毒理機制提供理論和實驗依據(jù),指導進一步基礎(chǔ)研究和臨床干預。方法:1于2013年9月19日-25日期間,于鄭州市非工業(yè)區(qū)使用大流量采樣器,每天24h連續(xù)采集樣品,把大氣細顆粒物收集在石英纖維濾膜載體上,運用不同的方法分析鄭州市PM2.5的指標,這些指標包括其質(zhì)量濃度和化學成分。洗脫石英纖維濾膜收集細顆粒物,提取水溶性成分真空冷凍干燥保存用于后續(xù)實驗。2 HBE細胞分別用設(shè)定濃度的WSPE染毒液(0、50、100、200、400、800μg/ml)暴露處理12h、24 h和48h,采用MTT法生長實驗檢測細胞存活率,觀察WSPE對HBE細胞增殖的影響,確定后續(xù)實驗的染毒劑量。3用0、50、100、200、400、800μg/ml WSPE染毒液暴露HBE細胞24h后,進行微核實驗,觀察WSPE對細胞的遺傳毒性;進行Hochst染色,定型的觀察觀察wspe對細胞凋亡的影響;進行流式細胞術(shù)實驗,觀察wspe對細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。4采用400mg/lwspe作為染毒劑,將實驗分為十組:(1)空白對照組;(2)wspe組;(3)wspe+nac組;(4)nac組;(5)pft-α+nac組;(6)pft-α組;(7)wspe+noxa-sirna組;(8)noxa-sirna組;(9)wspe+nc-sirna組;(10)nc-sirna組。其中n乙酰半胱氨酸(nac)為活性氧抑制劑,pft-α為p53抑制劑,noxa-rna和nc-rna為sirna,合成并將其用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入hbe細胞中。5對實驗組hbe細胞進行mtt生長實驗,觀察不同條件下細胞增殖的影響。6對實驗組hbe細胞進行流式細胞術(shù)實驗,觀察不同條件對細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。7westernblot法檢測目的蛋白p53和noxa的表達情況,以及caspase-3、caspase-9、cyt.c蛋白表達水平。8各組實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標準差(x±s)表示,采用spss12.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(onewayanova)。獨立樣本兩兩比較采用lsd法,檢測水準為α=0.05。結(jié)果:1鄭州市高新區(qū)pm2.5的日均濃度變化范圍為74.95 164.87μg/m3,日均值為122.76±30.01μg/m3。各種化學成分中碳元素和水溶性離子所占比重最大。2mtt生長實驗的結(jié)果表明,12h、24h、48h時200、400、800mg/l染毒組對細胞存活率有明顯抑制作用,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。用nac預處理細胞后,檢測細胞存活率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。用pft-α預處理后檢測細胞存活率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3wspe(≥200mg/l)均可使hbe細胞微核率顯著增高,對細胞的染色體產(chǎn)生不可逆損傷,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4不同濃度染毒組對hbe細胞進行染毒24h,細胞內(nèi)的活性氧(ros)含量隨著染毒濃度的升高而增加,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。用nac預處理細胞后,檢測細胞dcf陽性率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。用PFT-α預處理后檢測細胞DCF陽性率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5不同濃度染毒組細胞凋亡率隨濃度升高而升高,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。用NAC預處理細胞后,檢測細胞凋亡率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。用PFT-α預處理后檢測細胞凋亡率較染毒組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6 Western blot分析結(jié)果表明,隨著WSPE染毒時間延長,p53時間依賴性表達并下調(diào)Noxa。在WSPE染毒細胞中通過應(yīng)用PFT-α、NAC凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9和Cyt.c顯著變化變化。同時和NC-siRNA組相比,缺失Noxa直接減少WSPE誘導的caspase-3和caspase-9表達,Cyt.c釋放也受到抑制。結(jié)論:WSPE可以減低HBE細胞的存活率,導致染色體損傷,通過p53-Noxa通路介導的ROS產(chǎn)生誘導細胞凋亡。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R56

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本文編號：2326481