【摘要】：革蘭陰性桿菌感染可導(dǎo)致敗血癥、感染性休克甚至多器官功能衰竭,LPS(lipopolysaccharide,脂多糖)在發(fā)病機制中占有重要地位。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的正常結(jié)構(gòu)成分,臨床上又稱為內(nèi)毒素。在嚴重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下,大量內(nèi)毒素釋放入血,從而啟動炎癥和損傷。研究LPS致病機制及抑制LPS對機體的損傷在臨床上具有重要意義。 LPS介導(dǎo)炎性介質(zhì)IL-1(interleukin-1,白介素-1)、TNF-a (tumor necrosis factor alpha,腫瘤壞死因子-α等的表達,進一步促進NO (nitric oxide,一氧化氮)、TNF-α、白細胞介素、自由基等毒性細胞因子的釋放,從而導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)過程中伴有大量自由基產(chǎn)生,包括超氧陰離子、過氧化氫物、氫自由基、NO等,能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),破壞脂肪酸鏈和細胞膜的完整性,損傷細胞。 炎癥是機體對各種有害刺激所產(chǎn)生的一種以防御為主的病理反應(yīng)。血管反應(yīng)是炎癥過程的中心環(huán)節(jié)。有著強大分泌功能的血管內(nèi)皮細胞在革蘭陰性桿菌感染中有著重要的地位。內(nèi)毒素休克發(fā)生后,有效循環(huán)血量的減少和微血管通透性的增加是休克發(fā)生發(fā)展、最后導(dǎo)致組織損傷和器官功能損害的特征性表現(xiàn)。微血管通透性的增加主要取決于內(nèi)皮細胞單層的形態(tài)及細胞連接。炎癥過程的一個重要特征就是白細胞粘附、穿越血管內(nèi)皮細胞,向炎癥部位滲出。這一過程的重要分子基礎(chǔ)是白細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附分子的相互作用。內(nèi)毒素能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激,啟動粘附分子VCAM-1(vascular celll adhesion moleculer-1,血管細胞粘附分子-1)的表達。內(nèi)皮細胞表面的VCAM-1再介導(dǎo)白細胞和內(nèi)皮細胞的粘附,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,最終引起血管通透性增加,白細胞向組織內(nèi)遷移,大量白細胞浸潤,造成組織廣泛性損傷,形成LPS誘導(dǎo)的多臟器功能損害。以上病理過程表明,氧化應(yīng)激反應(yīng)在內(nèi)毒素等引起的炎癥及組織損傷中起重要作用,也提示,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可能成為一個治療路徑,來控制革蘭陰性桿菌感染導(dǎo)致的機體損傷。 ECSOD (extracellular superoxide dismutase,細胞外超氧化物歧化酶)又稱SOD3,可清除02-生成H202和02,H202在過氧化氮酶或過氧化物酶和還原劑的作用下生成無毒性的H2O,從而達到保護細胞和機體組織的作用。ROS(reactive oxygen species,活性氧)和內(nèi)皮損傷在敗血癥導(dǎo)致多臟器功能障礙綜合征的發(fā)病機制中的重要性說明胞外ROS是主角。既然ECSOD為結(jié)合到血管內(nèi)皮和多個器官細胞外基質(zhì)的主要的SOD,我們設(shè)想肌肉來源的ECSOD能在疾病中發(fā)揮保護性作用。因此我們用TNF-a體外刺激血管內(nèi)皮細胞,用LPS攻擊C57BL/6小鼠和肌肉來源ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠,觀察由此引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管粘附因子的表達、血管內(nèi)皮細胞及器官病理改變,研究分析ECSOD的作用及機制,有以下發(fā)現(xiàn)： 1. ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠血清中含有高濃度ECSOD。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),ECSOD-TG(transgene,轉(zhuǎn)基因)小鼠血清中ECSOD的表達含量遠高于WKwide type,野生型)C57BL/6小鼠血清。還在ECSOD基因轉(zhuǎn)染的HCECs(human cardiac endothelial cells,人心臟內(nèi)皮細胞)以及ECSOD-TG小鼠血清孵育后的未轉(zhuǎn)染ECSOD基因的HCECs表面,檢出ECSOD,為后續(xù)開展HCECs的有關(guān)研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 2. ECSOD能抑制TNF-α引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。HCECs在接受TNF-α刺激后迅速出現(xiàn)ROS (reactive oxygen species,活性氧)顯著升高,而這種瞬時升高現(xiàn)象并未出現(xiàn)在ECSOD血清提前共孵育的實驗組；在觀察TNF-α刺激延遲反應(yīng)時,HCECs加入TNF-α刺激4小時后,ECSOD降低了內(nèi)皮細胞在TNF-α刺激后的ROS生成。 3. ECSOD能抑制TNF-α引起的VCAM-1表達。TNF-α刺激后HCECs的VCAM-1表達增加,但在ECSOD存在的條件下,HCECs無論TNF-α刺激與否,VCAM-1的表達均未明顯增加；人單核細胞系THP-1細胞和內(nèi)皮細胞在TNF-α刺激下的細胞間粘附反應(yīng)在ECSOD存在的條件下也受到抑制,提示ECSOD抑制TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,抑制血管粘附因子的生成及單核細胞和內(nèi)皮細胞的粘附。 4. ECSOD對LPS攻擊具有一定保護作用。ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠接受LPS20mg/kg腹腔注射,存活率明顯高于WT小鼠。 5. ECSOD能改善LPS引起的白細胞浸潤和肺組織損傷。 (1)WT小鼠在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時后,肺部組織出現(xiàn)明顯充血和白細胞浸潤,ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時后,肺部組織表現(xiàn)基本正常。 (2)4-HNE(4-hydroxynonenal,4-羥基壬烯酸)免疫組化染色顯示,在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時后,WT小鼠肺部組織產(chǎn)生大量4-HNE, ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠肺部組織僅有少量4-HNE存在,提示LPS引起的組織氧化應(yīng)激反應(yīng)受ECSOD抑制與肺部組織損傷改善有關(guān)。 (3) VCAM-1免疫組化染色顯示,在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時后,WT小鼠肺部組織動、靜脈血管內(nèi)皮細胞VCAM-1產(chǎn)生明顯增加,ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)為相對少量的VCAM-1的產(chǎn)生,與肺部組織在氧化應(yīng)激反應(yīng)被ECSOD抑制后白細胞浸潤減少有相關(guān)性。 總之,本文在細胞學(xué)水平研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細胞HCECs在TNF-α刺激后,產(chǎn)生ROS增加(包括瞬間反應(yīng)和延遲反應(yīng)),內(nèi)皮細胞VCAM-1的表達增加,EC-SOD能減少這種情況下內(nèi)皮細胞ROS的生成和VCAM-1的表達,反映出我們所用的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的肌肉來源的ECSOD對氧化應(yīng)激反應(yīng)的有抑制,及相應(yīng)的白細胞和內(nèi)皮細胞粘附減少的現(xiàn)象;在動物實驗水平研究發(fā)現(xiàn),C57BL/6小鼠接受LPS腹腔注射后,肺部氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加、VCAM-1表達上調(diào),肺組織充血、白細胞浸潤等炎癥表現(xiàn)明顯,而ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠對LPS刺激的反應(yīng)則明顯弱于前者,表現(xiàn)出顯著增高的存活率,提示肌源性ECSOD對LPS攻擊造成的致死性損傷有一定保護作用：同時此ECSOD可能通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激而減輕肺組織損傷。據(jù)此,我們認為ECSOD作為有效的胞外氧化抑制劑,通過抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng),穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能,下調(diào)血管內(nèi)皮粘附因子表達,減少白細胞對血管內(nèi)皮細胞的粘附,從而降低白細胞的遷移率,改善組織炎癥損傷,在革蘭陰性桿菌的感染中起到了保護作用。這對于革蘭陰性桿菌感染致敗血癥甚至多臟器功能損傷的發(fā)病機制的研究及探索臨床上細胞外抗氧化措施在抗感染治療中的作用有潛在應(yīng)用價值。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563

【參考文獻】

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1 盧霽明;梁寒光;;辦公樓照明設(shè)計淺議[J];燈與照明;2010年03期

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本文編號：2290963