【摘要】：研究背景和目的： 淋巴細胞微粒(lymphocyte microparticles，LMPs)是當淋巴細胞受刺激活化或凋亡時從漿膜上脫落下來成為直徑為0.05-1.0μm的小囊泡顆粒，可通過與靶細胞的相互作用啟動靶細胞的生物學效應[1]。它具有抗凝、促炎反應、加重內(nèi)皮損傷、影響血管收縮、誘導血管生長以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性[2]，尤其在慢性炎癥方面作用突出，，現(xiàn)已證實它與自身免疫性疾病關系密切。 新近研究發(fā)現(xiàn)，LMPs能誘導巨噬細胞的凋亡，能夠作用于內(nèi)皮細胞誘導炎性介質(zhì)白細胞介素6(interleuki-6，IL-6)、白細胞介素8(interleuki-8，IL-8)、前列腺素(Prostaglandin，PG)等的表達[3]，進而在調(diào)節(jié)免疫反應方面起重要作用，但具體機制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者外周血T淋巴細胞總數(shù)下降，凋亡增加，在急性加重期尤為突出[4]。我們課題組初步發(fā)現(xiàn)COPD患者的肺泡灌洗液中LMPs水平是升高的，但凋亡的T淋巴細胞所釋放的LMPs是否對氣道上皮細胞有影響，是否在氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,目前在國內(nèi)外尚缺乏研究報道。針對這一現(xiàn)象我們加以假設展開研究。 我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LMPs能抑制人支氣管上皮細胞(Human bronchial epithelialcells，16HBE)生長，使其生長周期阻滯在G1期，并且能誘導其凋亡，但引起16HBE細胞生長周期阻滯的具體機制尚不完全清楚[5]。因此，本研究擬通過對細胞生長周期調(diào)控基因以及相關周期蛋白的變化檢測，探討LMPs引起16HBE細胞生長周期阻滯的機制。以期為研究LMPs在氣道炎癥中所發(fā)揮的作用提供實驗依據(jù)，為下一步構建疾病動物模型作鋪路，最終為呼吸專科常見的哮喘和慢性阻塞性肺氣腫等慢性氣道炎癥性疾病防治提供新的思路。 方法 本實驗采用人類正常支氣管上皮細胞株(16HBE)進行體外實驗，對LMPs作用于16HBE細胞引起生長周期阻滯的相關調(diào)控蛋白進行檢測，并對其具體機制進行探討。具體如下： 1、LMPs致16HBE細胞生長周期阻滯相關周期蛋白的研究 1.1RT-PCR檢測P21、P27、P57、P16的mRNA的水平表達 將16HBE細胞培養(yǎng)在六孔板中到對數(shù)生長期時，20μg/ml的LMPs按照不同的時間0h、4h、8h、16h、20h、24h刺激16HBE細胞，提取總的RNA。采用引物延伸法，擴展目的片段，取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳跑電泳進行分析。并用GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)。GIS密度分析軟件分析目的基因條帶的灰度值。 1.2Western blot檢測P21、 P27蛋白水平表達 將16HBE細胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，20μg/ml的LMPs按照不同的時間0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE細胞。提取蛋白，跑電泳，轉膜，孵育抗體，ECL試劑反應顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 2、LMPs致16HBE細胞生長周期阻滯機制的研究 2.1Western blot檢測p-FOXO1、FOXO1、p-AKT、AKT蛋白水平的表達情況 將16HBE細胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，20μg/ml的LMPs按照不同的時間0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE細胞。提取蛋白，跑電泳，轉膜，孵育抗體，ECL試劑反應顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 2.2激光共聚焦觀察FOXO1蛋白的核定位變化 按照1.5×10~4個細胞/孔的密度種植16HBE細胞爬片，60-70%的融合率時，按照0h、24h的時間點加入濃度為20μg/ml的LMPs刺激16HBE細胞。然后固定，通透，孵育抗體，染核，封片；激光共聚焦觀察。 2.3加入抑制劑LY294002后，Western blot檢測p-AKT、AKT、p-FOXO1、FOXO1蛋白水平的表達情況 60-70%的融合率時，向16HBE細胞中加入濃度為20μm/L的LY294002，共培養(yǎng)24h后，加入20μg/ml的LMPs刺激16HBE細胞24h。提取蛋白，跑電泳，轉膜，孵育抗體；ECL試劑反應顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 2.4加入抑制劑LY294002后，激光共聚焦觀察FOXO1蛋白的核定位變化 按照1.5×10~4個細胞/孔的密度種植爬片，60-70%的融合率時，向16HBE細胞中加入濃度為20μm/L的LY294002共培養(yǎng)24h后，加入濃度為20μg/ml的LMPs刺激16HBE細胞24h。然后固定，通透，孵育抗體，染核，封片；激光共聚焦觀察。 2.5加入抑制劑LY294002后,Western blot檢測P21、P27蛋白水平的表達情況 60-70%的融合率時，向16HBE細胞中加入濃度為20μm/L的LY294002共培養(yǎng)24h后，20μg/ml的LMPs加入刺激16HBE細胞24h。提取蛋白，跑電泳，轉膜，孵育抗體；ECL試劑反應顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 結果： 1、LMPs致16HBE細胞生長周期阻滯相關周期蛋白的研究 1.1濃度為20μl/ml的LMPs刺激16HBE細胞，24h能夠使其生長周期阻滯在G1期(P0.01)。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，P21、P27在mRNA水平隨著時間點的變化顯著升高(P0.01)，而P57、P16在mRNA水平無明顯變化(P0.05)。 1.2Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，P21、P27在蛋白水平隨時間點的變化表達亦明顯升高,具有統(tǒng)計學差異(P0.01)。 2、LMPs致16HBE細胞生長周期阻滯機制的研究 2.1Western blot檢測FOXO1、p-FOXO1、AKT、p-AKT蛋白水平變化情況，結果顯示：FOXO1、AKT的總表達水平無明顯變化；但p-FOXO1、p-AKT表達水平隨時間點變化逐漸減弱(P0.01)。 2.2細胞免疫化學觀察到FOXO1在24h明顯入核的現(xiàn)象(與0h比較))。 2.3加入抑制劑LY294002后, FOXO1、AKT蛋白表達水平無明顯變化，但其磷酸化水平增強(P0.01)；FOXO1的核定位在24h后未觀察到明顯的進核現(xiàn)象，P21、P27蛋白表達水平無明顯增高(P0.05)。 結論： 1. LMPs作用于16HBE細胞引起其生長周期阻滯在G1期，是通過上調(diào)P21、P27的表達來實現(xiàn)的。 2. LMPs抑制16HBE細胞的生長可能與p-AKT以及FOXO1的核定位有關。 3. LMPs作用于16HBE細胞上調(diào)P21、P27蛋白的表達引起生長周期阻滯在G1期可能是通過AKT/FOXO1信號通路調(diào)節(jié)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R563

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本文編號：2267687