【摘要】：背景： 阻塞性睡眠呼吸暫停（Obstructive sleep apnea, OSA）是臨床常見的睡眠呼吸紊亂性疾病，主要表現(xiàn)為睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)的上氣道完全或部分阻塞所致的呼吸暫停和呼吸淺慢，伴隨乏氧、睡眠覺醒和血流動力學(xué)變化，其中，OSA所致的慢性間歇性乏氧（Chronic intermittent hypoxia, CIH）是引起其病理改變的主要成分。OSA是心血管疾病的獨立危險因素，與心血管疾病的發(fā)病率及死亡率增高直接相關(guān)，因此，OSA已成為減少心血管疾病的公共健康干預(yù)的重要靶點。 雖然OSA與多種心血管疾病密切相關(guān)，但OSA對心血管系統(tǒng)影響的動態(tài)過程及其機制尚未完全明了，目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是OSA所致心血管疾病的主要發(fā)病機制之一，我們推測：OSA對心血管系統(tǒng)的影響及其所致氧化應(yīng)激存在時間依賴效應(yīng)。金屬硫蛋白（Metallothionein, MT）是一種非特異性、內(nèi)源性、強有力的抗氧化劑，在包括心臟在內(nèi)的多個器官中表達，我們推測：MT作為內(nèi)源性抗氧化劑能通過其抗氧化作用保護OSA所致的心肌損傷。目前有關(guān)心臟對CIH的動態(tài)反應(yīng)及MT在OSA所致心血管疾病中是否具有保護作用尚未見報道。 目的： 本研究應(yīng)用CIH處理的小鼠模型模擬OSA患者的疾病狀態(tài)。首先給予野生型FVB小鼠不同時間的CIH處理，旨在觀察心臟對CIH反應(yīng)的動態(tài)變化規(guī)律，以闡明心臟對CIH的反應(yīng)是否存在時間依賴效應(yīng)，并闡明CIH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否為其誘導(dǎo)心肌損傷的主要發(fā)病機制。同時應(yīng)用抗氧化劑治療，進一步明確氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的作用，并應(yīng)用心臟特異性過表達金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠（Metallothionein-transgene, MT-TG）的CIH模型，觀察MT對CIH所致心肌損傷是否具有保護作用，以明確MT作為內(nèi)源性抗氧化劑是否能保護CIH所致的心肌損傷，從而進一步論證氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的機制，以期為臨床預(yù)防及治療OSA所致心血管疾病提供理論依據(jù)并試圖尋找新的藥物治療靶點。 方法： 本研究共分三部分進行：1）應(yīng)用CIH處理的野生型FVB小鼠模型，給予不同時間的CIH處理，分別從心臟的結(jié)構(gòu)和功能及細(xì)胞和分子水平觀察心臟對CIH的反應(yīng)是否存在時間依賴效應(yīng)并進行機制研究；2）應(yīng)用抗氧化劑處理FVB小鼠，并給予CIH處理，擬闡明氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的作用；3）給予MT-TG鼠及其野生型FVB鼠CIH處理4周及8周，除進一步觀察心臟對CIH反應(yīng)的時間依賴效應(yīng)外，同時觀察心肌組織MT的過表達是否對CIH誘導(dǎo)的心肌損傷有保護作用，以進一步應(yīng)用MT-TG鼠論證氧化應(yīng)激在OSA所致心肌損傷中的作用。 1心臟對CIH反應(yīng)的時間依賴效應(yīng) 為觀察心臟對CIH反應(yīng)的時間依賴效應(yīng)，我們將8-10周雄性野生型FVB鼠暴露于CIH3天、7天（1周）、14天（2周）、21天（3周）、28天（4周）及56天（8周），動態(tài)觀察下述指標(biāo)的變化以明確心臟對CIH反應(yīng)的時間依賴效應(yīng)及其機制。 （1）體重、心臟重量及心臟重量與脛骨長度比值：在不同時間點測量體重、心臟重量、脛骨長度，并計算心臟重量與脛骨長度比值作為心臟的相對重量，用以觀察CIH是否影響動物生長并誘導(dǎo)心肌肥厚。 （2）心肌肥厚標(biāo)志基因檢測：應(yīng)用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time polymerasechain reaction, RT-PCR）及免疫印跡技術(shù)（Western-blot）檢測心肌肥厚標(biāo)志基因：心房利鈉肽（Atrial natriuretic peptide, ANP）及β-肌紅蛋白重鏈（β-myosin heavy chain,β-MHC）的mRNA及ANP的蛋白質(zhì)表達。 （3）心臟結(jié)構(gòu)及功能檢測：應(yīng)用超聲心動圖在不同時間點檢測心臟結(jié)構(gòu)及功能。 （4）心肌纖維化檢測：應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)：結(jié)締組織生長因子（Connective tissue growth factor, CTGF）及血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-1（Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）的蛋白質(zhì)表達，并應(yīng)用天狼星紅染色檢測心肌組織膠原沉積。 （5）心肌組織炎癥檢測：應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測炎癥相關(guān)指標(biāo)：細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1（Intracellular adhesion molecule-1, ICAM-1）及血管細(xì)胞粘附分子-1（Vascularcell adhesion molecule-1, VCAM-1）的蛋白質(zhì)表達，并應(yīng)用特異性萘酚A.S-D氯醋酸酯酶染色方法檢測心肌中性粒細(xì)胞浸潤。 （6）心肌細(xì)胞凋亡檢測：應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)：CIEBP同源蛋白（CIEBP homologous protein, CHOP）及裂解的Caspase-3（Cleaved-caspase-3, C-Cas-3）的蛋白表達，并應(yīng)用TUNEL染色檢測心肌組織凋亡陽性細(xì)胞浸潤情況。 （7）心肌氧化損傷檢測：應(yīng)用硫代巴比土酸方法檢測心肌組織脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛（Malondialdehyde, MDA）的含量，并應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測心肌組織抗氧化指標(biāo)：MT、銅/鋅過氧化物酶（SOD1）及核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor-erythroid2-related factor2, Nrf2）的表達，同時應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測心肌組織MT的表達。 2CIH所致心肌損傷機制研究 為明確CIH所致心肌損傷的機制，分別應(yīng)用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX)抑制劑Apocynin （3mg/Kg/日，腹腔注射，4周）及超氧化物歧化酶模擬劑MnTMPyP（5mg/Kg/日，腹腔注射，4周）處理FVB小鼠，并對部分鼠給予CIH4周，分別從大體標(biāo)本、心功能及分子水平觀察應(yīng)用抗氧化劑后心臟對CIH的反應(yīng)，以明確氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的作用。 3MT對CIH所致心肌損傷保護作用的研究 為進一步明確氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的作用并探討MT作為內(nèi)源性抗氧化劑是否對CIH所致心肌損傷有保護作用，我們將8-10周雄性MT-TG鼠及年齡相應(yīng)的野生型FVB鼠同時暴露于CIH4周及8周，觀察MT-TG鼠心臟對CIH的反應(yīng)，并通過在MT-TG鼠中觀察到的保護作用進一步反證氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的作用。觀察及檢測指標(biāo)同上。 結(jié)果： 1野生型FVB鼠心臟對CIH反應(yīng)的時間依賴效應(yīng) （1）體重：對照組體重隨年齡遞增，CIH組體重在處理的相對早期（3天至3周）及晚期（8周）均明顯低于對照組，4周時兩組體重?zé)o顯著差異。 （2）心臟重量及心臟重量與脛骨長度比值：不同時間點，對照組及CIH組脛骨長度無顯著差異，CIH組在暴露1周時心臟絕對重量及相對重量均顯著低于對照組，隨CIH暴露時間的延長，CIH組心臟絕對重量及相對重量逐漸增加，至CIH暴露4周時，明顯高于對照組，說明CIH暴露4周可誘導(dǎo)心肌肥厚。 （3）ANP及β-MHC的表達：CIH組3周時，ANP及β-MHC的mRNA表達及ANP的蛋白表達開始增加，與對照組比較有顯著差異，4周時，上述指標(biāo)表達量進行性增加，8周時，CIH組上述指標(biāo)的表達量仍有增高，但兩組間無顯著性差異，該結(jié)果從分子水平證明了CIH暴露3周開始即可誘導(dǎo)心肌肥厚，4周時，可誘導(dǎo)包括心臟重量增加在內(nèi)的顯著的心肌肥厚。 （4）心功能改變：CIH組暴露3天至3周時，心臟結(jié)構(gòu)及功能無顯著改變，4周時，舒張期及收縮期左室內(nèi)徑（Left ventricle cavitary dimensions, LVID）顯著高于對照組，左室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricle ejection fraction, LVEF）及左室短軸縮短率（Leftventricle fraction shortening, LVFS）明顯降低，8周時，CIH組舒張期室間隔厚度（Interventricle septem thickness, IVS）、舒張期及收縮期左室后壁厚度（Left ventricleposterior wall thickness, LVPW）明顯低于對照組，舒張期及收縮期LVID進一步增加， LVEF及LVFS進行性下降，說明隨著CIH暴露時間的延長，心臟逐漸從肥厚向擴張轉(zhuǎn)化，左室收縮功能進行性減退。 （5）心肌纖維化：在CIH暴露3天至3周時，CIH組心肌組織未見明顯膠原沉積，4周及8周時，CIH組可見心肌組織膠原沉積，且8周明顯重于4周，CTGF及PAI-1的蛋白表達在4周及8周時均明顯高于對照組，說明自CIH暴露4周開始，心肌出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)。 （6）心肌炎癥反應(yīng)：CIH組暴露3天及1周時，心肌組織VCAM-1及ICAM-1的蛋白表達明顯低于對照組，4周時，CIH組VCAM-1及ICAM-1的表達明顯上調(diào)，且在心肌組織中可觀察到中性粒細(xì)胞浸潤，CIH暴露8周時心肌炎癥反應(yīng)消失。 （7）心肌細(xì)胞凋亡：在CIH暴露3天至3周時，未見心肌細(xì)胞凋亡，4周時，，心肌組織CHOP的蛋白表達明顯高于對照組，并在心肌組織中發(fā)現(xiàn)TUNEL染色陽性細(xì)胞，8周時，CIH組TUNEL染色陽性細(xì)胞增加，并伴有C-Cas-3的蛋白表達增加，說明自CIH暴露4周開始出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡。 （8）心肌氧化損傷：CIH組在暴露3天至3周時，心肌組織MDA含量與對照組比較無顯著差異，但在CIH暴露4周至8周時，CIH組MDA的含量顯著高于對照組，同時，心肌組織抗氧化指標(biāo)Nrf2及MT的表達在CIH暴露3天時顯著高于對照組，隨著CIH暴露時間的延長, Nrf2及MT的表達逐漸下調(diào)，自CIH暴露3周開始，MT的表達開始下調(diào)，自CIH暴露4周開始，Nrf2的表達開始下調(diào)，8周時二者的表達進一步降低，SOD1的表達在CIH暴露3天至4周時，兩組無顯著差異，但在CIH暴露8周時，CIH組SOD1的表達亦明顯降低，說明氧化損傷是CIH所致心肌損傷的主要發(fā)病機制，早期心表達下調(diào)是CIH所致心臟失代償反應(yīng)的主要原因。 2抗氧化劑治療對CIH誘導(dǎo)的心肌損傷的保護作用 應(yīng)用抗氧化劑治療后，對照組及CIH組體重、脛骨長度、心臟的絕對重量及相對重量以及心功能均未見顯著差異，同時從分子水平對ANP、CTGF、PAI-1、VCAM-1的蛋白表達進行了檢測，并檢測了兩組心肌組織MDA的含量，兩組間比較均無顯著性差異。結(jié)果提示，抗氧化劑對CIH所致心肌損傷有明確的保護作用，從而進一步證明氧化應(yīng)激在介導(dǎo)CIH所致心肌損傷中的作用。 3MT對CIH誘導(dǎo)的心肌損傷的保護作用 將MT-TG鼠暴露于CIH4周及8周發(fā)現(xiàn)，CIH組及對照組在不同時間點均未觀察到體重、脛骨長度、心臟絕對重量及相對重量的變化。同時，在CIH組及對照組未觀察到心肌肥厚、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡，心肌炎癥反應(yīng)及氧化損傷指標(biāo)的變化。說明MT對CIH誘導(dǎo)的心肌損傷有保護作用，同時也進一步證明在CIH暴露期間，心肌組織MT表達的變化在CIH誘導(dǎo)的心臟代償及失代償反應(yīng)中的作用以及氧化應(yīng)激在CIH所致心肌損傷中的重要作用。 結(jié)論： 1心臟對CIH的反應(yīng)存在時間依賴效應(yīng)，即在CIH暴露早期表現(xiàn)為代償性反應(yīng)，而在CIH暴露的相對晚期表現(xiàn)為失代償性反應(yīng)。 2氧化損傷是CIH所致心肌損傷的主要發(fā)病機制，機體抗氧化能力下降是引起氧化損傷的主要原因，應(yīng)用NOX抑制劑及超氧化物歧化酶模擬劑可以抑制CIH所致心肌損傷。 3心肌組織MT的表達變化是心臟對CIH反應(yīng)從代償向失代償轉(zhuǎn)化的主要原因。 4MT作為內(nèi)源性抗氧化劑對CIH所致心肌損傷有明確的保護作用。 創(chuàng)新點： 1動態(tài)觀察了心臟對CIH的反應(yīng)，從細(xì)胞及分子水平系統(tǒng)闡述了心臟對CIH反應(yīng)的時間依賴效應(yīng)。 2進一步闡明氧化應(yīng)激是CIH誘導(dǎo)心肌損傷的主要機制，機體抗氧化能力下降是引起氧化應(yīng)激的主要原因。 3首次證明心肌組織MT表達的變化在CIH所致的心臟從代償向失代償轉(zhuǎn)化中的作用。 4首次證明MT作為內(nèi)源性抗氧化劑對CIH所致心肌損傷的保護作用。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R56;R541

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張翼,鐘寧,朱海峰,周兆年;間歇性低氧處理大鼠心肌的抗心律失常與抗氧化效應(yīng)[J];生理學(xué)報;2000年02期

2 張翼;楊黃恬;周兆年;;間歇性低氧適應(yīng)的心臟保護[J];生理學(xué)報;2007年05期

3 王瑩萍;崔芳;張利萍;楊長瑛;關(guān)s

本文編號：2247241