發(fā)布時間：2018-05-17 12:59

  本文選題：中藥組分 + 炎癥　； 參考：《復旦大學》2012年博士論文

【摘要】：目的 經(jīng)過長期的科研及臨床研究,我們發(fā)現(xiàn)補腎益氣方藥能夠治療氣道等的炎癥性疾病。中藥經(jīng)驗方劑補腎益氣方(淫羊藿、黃芪、生地)和補腎益氣清熱方(淫羊藿、黃芪、黃芩、生地)是本研究團隊在診療哮喘、COPD等慢性呼系統(tǒng)炎癥性疾病的過程中總結(jié)出的有效方劑,它對中醫(yī)辨證為腎陽虛、腎氣虛或肺腎兩虛或兼痰熱郁肺之侯的COPD和哮喘患者有較好的療效。 我們對補腎組分淫羊藿苷和清熱組分黃芩苷的前期實驗已證實淫羊藿苷對抑制脂多糖、卵蛋白等誘導的炎癥確切有效,黃芩苷對抑制香煙煙霧暴露誘導的炎癥確切有效,黃芪甲苷、生地梓醇等也有實驗證實對支氣管炎、心肌炎、肝炎等炎癥反應(yīng)有良好的抑制作用。但國內(nèi)外對淫羊藿苷、黃芩苷、黃芪甲苷和生地梓醇在香煙誘導產(chǎn)生的COPD炎癥反應(yīng)中作用如何及影響機制尚未有廣泛研究。 結(jié)合傳統(tǒng)醫(yī)學中淫羊藿、黃芪、黃芩及生地在治療肺脹、咳嗽、喘證的重要作用以及本團隊對補腎益氣方和補腎益氣清熱方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及確切臨床療效的認識,我們通過觀察中藥補腎組分淫羊藿苷、益氣組分黃芪甲苷、清熱組分黃芩苷和滋腎組分生地梓醇對香煙煙霧誘導的慢性阻塞性肺疾病(COPD)炎癥反應(yīng)的作用,探索中藥有效組、黃芪甲苷、黃芩苷和生地梓醇抑制CS所致的炎癥反應(yīng)的部分分子機制。 方法 1.建立香煙煙霧(CS)誘導的小鼠COPD炎癥反應(yīng)模型,并采用中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芩苷、生地梓醇和補腎益氣組分方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇合方)進行干預。隨機將小鼠分為18組,每組10只,分別是正常對照組、COPD模型組、COPD+地塞米松組(1mg/kg)組、COPD+淫羊藿苷高、中、低劑量組(100、50、25mg/kg)、COPD+黃芪甲苷高、中、低劑量組(40、20、10mg/kg)、COPD+黃芩苷高、中、低劑量組(100、50、25mg/kg)、COPD+生地梓醇高、中、低劑量組(20、10、5mg/kg)、 COPD+(淫羊藿苷+黃芪甲苷+生地梓醇)高、中、低劑量組。采用連續(xù)香煙煙霧暴露法建立小鼠COPD模型；測定小鼠實驗開始前和實驗結(jié)束時的體重；采用WBP全身體積描計儀檢測各組小鼠肺功能；采用HE染色制成病理切片在光學顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)、炎癥細胞浸潤、病理學評分、平均內(nèi)襯間隔(MLI)、肺泡破壞指數(shù)(DI)；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清及肺泡灌洗液(BALF)中IL-8、TNF-α、MMP-9的水平；采用免疫組織化學染色檢測各組小鼠肺組織組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)表達；采用Western blot法檢測各組小鼠肺組織HDAC2蛋白及磷酸化的HDAC2蛋白、GR蛋白和NF-κBP65蛋白、磷酸化的P65蛋白及IκB-α蛋白表達；采用HDAC2活性檢測試劑盒檢測各組小鼠肺組織HDAC2活性變化。 2.建立香煙提取液(CSE)干預A549細胞誘導的炎癥反應(yīng)模型,并采用中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芩苷和生地梓醇進行干預。觀察幾種中藥對CSE誘導的A549細胞炎癥反應(yīng)的作用時,細胞分組為：Control, CSE, CSE+淫羊藿苷(1、10、50μM),CSE+黃芪甲苷(1、10、50μM),CSE+黃芩苷(1、10、50μM),CSE+生地梓醇(1、10、50μM)、CSE+地塞米松(1μM)。采用CCK-8試劑盒檢測藥物對細胞的增殖與毒性作用；采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平；采用Western blot法檢測細胞HDAC2蛋白、GR蛋白和NF-κBP65蛋白表達；采用HDAC2活性檢測試劑盒檢測細胞HDAC2活性變化；采用real-time PCR檢測細胞HDAC2mRNA和GR mRNA表達。 結(jié)果 1.香煙煙霧暴露可明顯減輕小鼠體重,損傷小鼠肺功能從而降低小鼠PEF、PIF及MV,導致小鼠肺組織炎癥細胞浸潤、肺組織結(jié)構(gòu)改變及肺氣腫發(fā)生,并能顯著升高小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α和MMP-9水平,損傷小鼠肺組織HDAC2活性及蛋白表達,誘導HDAC2磷酸化,降低小鼠肺組織GR蛋白表達,增強P65磷酸化、降低IκB-α表達從而激活NF-κB信號通路(P0.05)。香煙煙霧提取液刺激A549細胞可誘導類似的炎癥反應(yīng),導致細胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著升高,并能降低細胞核HDAC2的活性及蛋白表達,抑制GR mRNA表達,激活NF-κB信號通路(P0.05)。 2.淫羊藿苷體內(nèi)實驗證實能恢復COPD小鼠體重,保護COPD小鼠肺功能從而提高小鼠PEF、PIF及MV,降低MLI和DI從而減輕COPD小鼠肺氣肺情況,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤,抑制COPD小鼠肺組織NF-κB P65磷酸化和增強IκB-α表達,增強HDAC2活性及蛋白表達并抑制HDAC2磷酸化、促進GR表達(P0.05)。 3.黃芪甲苷體內(nèi)實驗證實能恢復COPD小鼠體重,降低MLI和DI從而減輕香煙煙霧暴露所致的COPD小鼠肺氣腫情況,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液(BALF)中MMP-9的水平、BALF由TNF-α的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤,抑制NF-κBP65磷酸化(P0.05),但對IκB-α蛋白無明顯作用(P0.05)。 4.黃芩苷體內(nèi)實驗證實能恢復COPD小鼠體重,保護COPD小鼠肺功能從而提高小鼠PEF、PIF及MV,降低MLI和DI從而減輕COPD小鼠肺氣腫情況,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤,抑制COPD小鼠肺組織NF-κBP65磷酸化和增強IκB-α表達,增強HDAC2活性及蛋白表達并抑制HDAC2磷酸化(P0.05)。黃芩苷對COPD小鼠GR蛋白表達無明顯作用(P0.05)。 5.生地梓醇體內(nèi)實驗證實能恢復COPD小鼠體重,減輕COPD小鼠肺氣肺情況,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤,促進COPD小鼠肺組織下調(diào)的GR蛋白表達,恢復IκB-α蛋白表達(P0.05),但對P65磷酸化無明顯作用(P0.05)。 6.組分復方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇)能保護COPD小鼠肺功能,恢復COPD小鼠體重,抑制COPD小鼠血.清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤(P0.05)。因此,三藥組分復方對CS誘導的炎癥反應(yīng)也有抑制作用。 7.地塞米松體內(nèi)實驗證實其干預COPD小鼠3個月后會導致小鼠體重明顯減輕,地塞米松干預不僅未能恢復COPD小鼠肺功能,而且還降低了COPD小鼠的肺功能。地塞米松能抑制COPD小鼠血清及BALF中IL-8和TNF-α水平(P0.05),但未能顯著降低COPD小鼠血清及BALF中MMP-9水平(P0.05),也未能明顯減輕COPD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤(P0.05)。地塞米松能抑制NF-κBP65磷酸化(P0.05),但對IκB-α蛋白表達的上調(diào)作用不十分明顯(P0.05)。地塞米松能恢復CS誘導的HDAC2活性(P0.05),但是對COPD小鼠肺組織HDAC2蛋白表達上調(diào)作用不十分明顯(P0.05)。地塞米松對COPD小鼠肺組織表達GR蛋白的作用,經(jīng)免疫組化顯示地塞米松無明顯上調(diào)GR表達的作用(P0.05),經(jīng)Western blot檢測證實可以明顯上調(diào)GR表達(P0.05)。 8.淫羊藿苷體外實驗證實其能抑制CSE刺激的A549細胞釋放IL-8和TNF-α,抑制NF-κBP65蛋白表達,增強HDAC2活性及蛋白表達、促進GR mRNA表達(P0.05)。 9.黃芪甲苷體外實驗證實能抑制CSE刺激的A549細胞釋放IL-8和TNF-α,抑制NF-κBP65表達(P0.05),可見黃芪甲苷可能是通過P65及磷酸化的途徑來抑制CS誘導的NF-κB激活。黃芪甲苷雖能恢復HDAC2活性(P0.05),且體內(nèi)實驗證實能上調(diào)HDAC2蛋白表達(P0.05),但未在體外實驗中得到證實,因此其對HDAC2的影響不明確。 10.黃芩苷體外實驗證實其能抑制CSE刺激的A549細胞釋放IL-8和TNF-α,抑制NF-κBP65表達,增強HDAC2活性及蛋白表達(P0.05)。 11.生地梓醇體外實驗證實能抑制CSE刺激的A549細胞釋放IL-6、IL-8和TNF-α,促進GR mRNA的表達(P0.05)。生地梓醇雖能恢復HDAC2活性,且體內(nèi)實驗證實能上調(diào)HDAC2蛋白表達(P0.05),但未在體外實驗中得到證實,因此其對HDAC2的影響尚需考察。 12.地塞米松體外實驗證實其在CSE誘導的A549炎癥反應(yīng)模型中,對細胞釋放IL-8的抑制作用不如地塞米松在TNF-α誘導的A549炎癥反應(yīng)模型中對IL-8的抑制作用。地塞米松對CSE干預的A549細胞表達HDAC2蛋白有上調(diào)作用(P0.05),但這一結(jié)果未在體內(nèi)實驗中得到證實。 結(jié)論 1.本實驗中,香煙煙霧暴露可誘導小鼠發(fā)生COPD炎癥反應(yīng),減輕小鼠體重,降低小鼠肺功能,導致小鼠肺組織炎癥細胞浸潤及肺氣腫發(fā)生,并能顯著升高小鼠血清及肺泡灌沈液中IL-8、TNF-α和MMP-9水平,損傷小鼠肺組織HDAC2作用及GR表達,激活NF-κB信號通路。香煙煙霧提取液刺激A549細胞可誘導類似的炎癥反應(yīng),導致細胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著升高,并能損傷細胞核HDAC2作用及GR表達,激活NF-κB信號通路。因此,HDAC2、GR和NF-κB信號通路均參與了CS誘導的炎癥反應(yīng),且HDAC2的作用損傷和GR的表達降低可能間接促進了NF-κB活化程度的增強。 2.補腎組分淫羊藿苷對香煙煙霧暴露所致的炎癥反應(yīng)有抑制作用,其作用機制可能是通過抑制NF-κB活化、恢復HDAC2的作用以及促進GR表達途徑實現(xiàn)的。其抑制NF-κB活化的作用與其抑制NF-κBP65磷酸化及增強IκB-α表達有關(guān)；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能與抑制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其能抑制MMP-9的水平有關(guān)。 3.益氣組分黃芪甲苷對香煙煙霧暴露所致的炎癥反應(yīng)有部分抑制作用,其作用機制可能是通過抑制NF-κB活化途徑實現(xiàn)的。其抑制NF-κB活化的作用與其抑制NF-κBP65磷酸化有關(guān)；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能與其抑制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其抑制MMP-9的水平有關(guān)。 4.清熱組分黃芩苷對香煙煙霧暴露所致的炎癥反應(yīng)有抑制作用,其作用機制可能是通過抑制NF-κB活化以及恢復HDAC2作用途徑實現(xiàn)的。其抑制NF-κB活化的作用與其抑制NF-κBP65磷酸化及增強IκB-α表達有關(guān)；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能與抑制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其能抑制MMP-9的水平有關(guān)。 5.滋腎組分生地梓醇對香煙煙霧暴露所致的炎癥反應(yīng)有抑制作用,其作用機制可能是通過抑制NF-κB活化以及促進GR表達途徑實現(xiàn)的。其抑制NF-κB活化的作用與其增強IκB-α表達有關(guān)；其降低IL-6、IL-8和TNF-α水平的作用可能與抑制NF-κB活化有關(guān)；其改善肺氣腫的作用可能與其抑制MMP-9的水平有關(guān)。 6.組分復方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇)能保護COPD小鼠肺功能,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺組織炎癥細胞浸潤。因此,三種中藥組分的復方對香煙煙霧暴露誘導的炎癥反應(yīng)也有抑制作用。 7.中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷、黃芩苷和生地梓醇以及組分復方(淫羊藿苷、黃芪甲苷和生地梓醇組方)對香煙煙霧暴露誘導的COPD小鼠炎癥模型或CSE誘導的A549細胞炎癥模型的炎癥反應(yīng)均有不同程度的抑制作用,其中黃芪甲苷拮抗炎癥的作用不如淫羊藿苷、黃芩苷和生地梓醇。 8.本實驗中,地塞米松能部分、但不能完全有效地抑制香煙煙霧暴露誘導的炎癥反應(yīng),這與國外的研究基本一致。原因之一是香煙煙霧暴露誘導的炎癥反應(yīng)的確存在激素抵抗現(xiàn)象,且可能與地塞米松不能有效恢復香煙煙霧暴露抑制的HDAC2作用以及不能有效促進GR表達有關(guān)。另一個原因可能是與本實驗采用的地塞米松1mg/kg(小鼠)和1μM(A549細胞)的使用劑量偏低有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R285;R563.9

【引證文獻】

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本文編號：1901477