應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)結(jié)核菌感染的研究
本文關(guān)鍵詞：全血γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)在菌陰肺結(jié)核和結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
《河北醫(yī)科大學(xué)》 2007年
應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)結(jié)核菌感染的研究
李嶠珂
【摘要】： 目的:建立應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme Linked- immunospot Assay,ELISPOT)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核菌感染的方法,初步研制酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試劑盒(簡(jiǎn)稱自制試劑盒),并評(píng)價(jià)其在結(jié)核病診斷臨床中的應(yīng)用價(jià)值。 方法:選擇30例非結(jié)核感染志愿者,26例結(jié)核病人和4例結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性、無(wú)任何結(jié)核病臨床癥狀且相關(guān)檢查結(jié)果無(wú)異常的志愿者,用英國(guó)Oxford Immunotec公司研制的T SPOT-TB試劑盒(簡(jiǎn)稱T SPOT-TB試劑盒)檢驗(yàn)。 根據(jù)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在特異抗原的刺激下分泌γ-干擾素(IFN-γ),檢測(cè)IFN-γ可以確定體內(nèi)是否存在對(duì)結(jié)核桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的原理,建立應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)結(jié)核菌感染的方法。預(yù)先用IFN-γ單克隆抗體包被96孔硝酸纖維素膜板,用密度-梯度離心法分離被檢測(cè)者外周血單核細(xì)胞,加入96孔板中,用特異性重組ESAT-6蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白刺激,活化細(xì)胞,結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞將分泌IFN-γ,然后加入生物素標(biāo)記的IFN-γ多克隆抗體作為檢測(cè)抗體,再加入堿性磷酸酶(AKP)標(biāo)記的鏈親和素,加入底物BCIP/NBT溶液顯色,在板底形成肉眼可見(jiàn)的深藍(lán)色斑點(diǎn)。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞。根據(jù)體內(nèi)是否存在結(jié)核桿菌效應(yīng)T淋巴細(xì)胞,對(duì)結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。 改變不同的實(shí)驗(yàn)條件確定應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌感染方法的最佳細(xì)胞濃度、孵育時(shí)間,蛋白濃度等,初步研制自制ELISPOT試劑盒。選擇32例非結(jié)核感染志愿者和31例結(jié)核病人,均使用T SPOT-TB試劑盒和自制試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。將兩者檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果:用T SPOT-TB試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn),30例結(jié)核感染者的血樣本檢測(cè)結(jié)果93.3%(28/30)陽(yáng)性,6.7%(2/30)陰性,30例非結(jié)核感染者檢測(cè)結(jié)果96.6%(29/30)陰性,3.4%(1/30)陽(yáng)性。 改變不同的實(shí)驗(yàn)條件來(lái)確定自制試劑盒的各個(gè)合適的實(shí)驗(yàn)條件,結(jié)果表明:2×105細(xì)胞密度較為合適,孵育時(shí)間20h為實(shí)驗(yàn)條件,刺激結(jié)核致敏T淋巴細(xì)胞的蛋白濃度20μg/ml為實(shí)驗(yàn)條件。 用T SPOT-TB試劑盒和自制試劑盒對(duì)32例非結(jié)核感染者和31例結(jié)核病人進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果92.1%(58/63)T SPOT-TB試劑盒與自制試劑盒檢測(cè)結(jié)果相同,7.9%(5/63)結(jié)果不同。對(duì)兩種試劑盒檢出結(jié)果行χ2檢驗(yàn),兩者差異無(wú)顯著性(P0.05),說(shuō)明兩種試劑盒對(duì)血樣陽(yáng)性檢出率沒(méi)有顯著性差異。31例已確診結(jié)核病人檢測(cè)結(jié)果為:T SPOT-TB試劑盒87.1%(27/31)陽(yáng)性,自制試劑盒90.3%(28/31)陽(yáng)性。32例非結(jié)核感染者檢測(cè)結(jié)果為:T SPOT-TB試劑盒18.8%(6/32)陽(yáng)性,自制試劑盒25.0%(8/32)陽(yáng)性。自制試劑盒的敏感性略高于T SPOT-TB試劑盒。自制試劑盒的假陽(yáng)性率高于后者,但因所選病歷中包括消化系統(tǒng)和血液腫瘤患者,以及老年人等免疫低下者,不排除其為結(jié)核潛伏感染者,因機(jī)體免疫力低下,對(duì)PPD實(shí)驗(yàn)無(wú)反應(yīng)。故尚需進(jìn)一步的追蹤陽(yáng)性病例是否發(fā)病。自制試劑盒痰菌陽(yáng)性組檢測(cè)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)顯著高于痰菌陰性組檢測(cè)孔(P0.05),說(shuō)明痰菌陽(yáng)性患者體內(nèi)特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)有不同程度提高。 結(jié)論:英國(guó)Oxford Immunotec公司研制的T SPOT-TB試劑盒診斷結(jié)核病感染者的敏感度和特異性均較高;本研究建立了一種結(jié)核病細(xì)胞免疫診斷試劑盒,其診斷結(jié)核病感染者的敏感性和特異性與T SPOT-TB試劑盒相似,且操作簡(jiǎn)便,花費(fèi)小;ELISPOT在檢測(cè)結(jié)核潛伏感染者敏感性和特異性均高于PPD皮膚試驗(yàn)。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R446.6
【目錄】：
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【參考文獻(xiàn)】
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6 陳立;γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的亞群分析和誘導(dǎo)分化條件的探討[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2014年
7 許曉光;新型免疫佐劑（CpG ODN）的免疫調(diào)節(jié)作用及其在淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中的應(yīng)用研究[D];中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年
8 張秀英;T-SPOT-TB法檢測(cè)腦脊液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞對(duì)早期結(jié)核性腦膜炎診斷價(jià)值的研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2013年
9 呂帥然;兩種HIV-1重組腺病毒疫苗（修飾型，野生型）的構(gòu)建及免疫原性比較[D];吉林大學(xué);2006年
10 宋穎麗;水痘疫苗免疫效果檢測(cè)方法的初步建立[D];昆明理工大學(xué);2009年
本文關(guān)鍵詞：全血γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)在菌陰肺結(jié)核和結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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