本文關(guān)鍵詞：野生型P53基因誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡在海水吸入型肺損傷中的作用機(jī)制研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景： 海水淹溺是導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的常見病因。生活中，有很多因素可以導(dǎo)致ALI的發(fā)生，如異物誤吸，傳染性肺炎、毒物接觸等等，這其中就包括淹溺，尤其是海水淹溺。淹溺誘發(fā)的肺損傷多是由于氣道內(nèi)被動(dòng)吸入過多液體，破壞了肺泡結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肺水清除功能和氣體交換功能下降，最終發(fā)生肺水腫和通氣\血流比例下調(diào)，出現(xiàn)進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫，嚴(yán)重者會(huì)進(jìn)展成急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS），甚至死亡。近年來，關(guān)于海水淹溺性急性肺損傷的研究大量展開，但都是基于動(dòng)物模型基礎(chǔ)上的研究，關(guān)于其中的致傷機(jī)制也陸續(xù)被揭示。 凋亡是一種由基因控制的程序性細(xì)胞死亡過程。生理情況下的凋亡對(duì)于維持機(jī)體新陳代謝，促進(jìn)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有積極作用；病理情況下的凋亡尤其是過度凋亡，會(huì)導(dǎo)致死亡物質(zhì)大量堆積，死亡物質(zhì)的清除引起吞噬細(xì)胞的集聚，促使炎癥介質(zhì)大量釋放，，加重肺損傷。最近，ALI中肺泡上皮細(xì)胞凋亡的研究被大量報(bào)道。我科前期的研究發(fā)現(xiàn)，在海水吸入型急性肺損傷(seawater inhalation induced acute lung injury，SWI-ALI）中，肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡是增加的[1]。誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素有很多，調(diào)節(jié)通路更是多種多樣。野生型p53（wild type p53，wtp53）是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因子，SWI-ALI中，wtp53基因及其調(diào)節(jié)通路是否參與了海水誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，及相關(guān)作用機(jī)制未曾揭示。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?通過復(fù)制SWI-ALI大鼠模型，觀察海水吸入后對(duì)肺組織上皮細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)觀察野生型p53和其調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)基因及p38基因在海水作用時(shí)的表達(dá)，探討在海水吸入型肺損傷發(fā)生后野生型p53誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，并進(jìn)一步研究了海水觸發(fā)野生型p53表達(dá)的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 實(shí)驗(yàn)一：40只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、海水1、3、6、12h組，每組8只。4個(gè)海水處理組大鼠氣管內(nèi)注入4ml/kg海水，分別作用1h、3h、6h和12h；對(duì)照組除不吸人海水外，其余處理同海水淹溺組。于各時(shí)間點(diǎn)上放血處死大鼠，行動(dòng)脈血?dú)夥治�，測(cè)肺濕/干重比（W/D)， HE染色觀察肺組織病理形態(tài)改變，RT-PCR檢測(cè)wtp53、Bax、Bcl-2及細(xì)胞色素c（cytochrome-c，Cyt-c）mRNA的表達(dá)，免疫組化法分析wtp53、p-p38和Bax表達(dá)變化，western blotting分析wtp53、p38和p-p38、p-p53、Bax、Bcl-2和Cyt-c及活化caspase-3的蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二：新傳代的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)4天后干預(yù)。除對(duì)照組外均在培養(yǎng)基中加入海水，海水干預(yù)濃度為40%（即1ml總體積中含0.4ml海水），孵育時(shí)間為3h；實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、海水組、海水+PFT-α組、海水+SB203580組、海水+DMSO組，在加入海水后，立即將20μM的PFT-α、SB203580及10μl的DMSO加入培養(yǎng)基中共同孵育。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，Western blotting檢測(cè)各組p-p38、p-p53和其相關(guān)下游目的蛋白的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一：海水吸入后，血?dú)饨Y(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)了明顯的低氧血癥，HE結(jié)果示肺組織破壞嚴(yán)重，且海水作用時(shí)間越久，肺組織損傷越嚴(yán)重；海水吸入引起促凋亡基因wtp53、Bax及Cyt-c的mRNA表達(dá)增加（P0.05），抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA表達(dá)隨海水吸入時(shí)間增加逐漸下降；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)因子的蛋白表達(dá)與PCR的結(jié)果一致，我們還觀察了海水吸入后p38的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，海水升高了p38的磷酸化水平，且與p-p53及其下游促凋亡因子的增加趨勢(shì)一致。 實(shí)驗(yàn)二：流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，海水處理明顯引起A549細(xì)胞凋亡（P0.05vscontrol group），PFT-α和SB203580都可以抑制海水的這種促凋亡作用。海水單獨(dú)作用和海水+DMSO共孵育引起的凋亡結(jié)果無明顯不同，提示DMSO對(duì)海水作用無影響（P0.05）。蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與海水組比較，PFT-α和SB203580分別降低了海水組中p-p53的水平，但仍高于對(duì)照組，且PFT-α的抑制作用更明顯，這一點(diǎn)與細(xì)胞凋亡抑制結(jié)果一致；有趣的是，PFT-α只抑制了p-p53的表達(dá)，對(duì)p-p38無影響；SB203580在抑制p-p38表達(dá)的同時(shí)抑制了p-p53的表達(dá)；我們同時(shí)觀察到Bax、Cyt-c及cleaved caspase-3的表達(dá)被PFT-α和SB203580抑制，Bcl-2的表達(dá)反而增加。 結(jié)論： 野生型p53及其下游目的基因通過內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)了SWI-ALI時(shí)肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，P38MAPK作為p53的上游因子，通過磷酸化p53，部分地介導(dǎo)了海水吸入誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

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