發(fā)布時間：2017-12-11 14:13

  本文關(guān)鍵詞：氣道平滑肌細胞中GLP-1受體的表達對細胞增殖及炎癥因子的調(diào)節(jié)機制研究

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【摘要】：背景：慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的可預(yù)防可治療的疾病,其氣流受限多呈進行性發(fā)展,通常肺實質(zhì)和氣道伴有慢性炎癥表現(xiàn)。COPD的致死率和致殘率較高,目前居全球死亡原因的第五位。COPD包括肺氣腫和慢性支氣管炎,但它們有持續(xù)氣道受限才是COPD。據(jù)文獻報道,炎癥反應(yīng)在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,但是,部分科學(xué)家對此抱有異議。COPD的發(fā)病機理十分復(fù)雜,目前認為COPD的氣道平滑肌增殖及氣道重塑都與炎癥刺激有關(guān)。氣道壁被炎癥細胞浸潤后,這些炎癥細胞和氣道平滑肌細胞還會釋放各種細胞因子和炎癥介質(zhì)。因此,要想控制炎癥反應(yīng)和延緩氣道重塑,我們可以從氣道平滑肌細胞入手。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1)是由腸道L細胞所分泌的一種肽類激素,屬于腸促胰液素,有明顯的降糖作用。實驗表明,在阻塞性肺疾病雌性大鼠動物試驗中,GLP-1有明顯的改善肺功能和降低死亡率的作用。GLP-1通過與胰島β細胞上的特異性受體結(jié)合發(fā)揮促進胰島素生成和分泌的作用。此外,GLP-1還有胰腺外的作用,比如,它可以調(diào)節(jié)飲食行為、控制食欲,抑制胃腸運動、抑制消化液分泌及心肌保護作用。GLP-1對這些不同類型靶細胞發(fā)揮作用都是通過GLP-1受體完成的。GLP-1受體在胰島、心臟、大腦、腎臟、胃腸道和肺都有表達。GLP-1具有抗炎作用,實驗發(fā)現(xiàn)它可以抑制脂多糖所誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞和大腦皮層星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)中細胞因子的分泌。GLP-1有抗炎作用,因此GLP-1受體的激動劑在COPD治療中也有重要作用。雖然已證實GLP-1受體在慢性阻塞性肺疾病中有作用,但它的作用機制現(xiàn)在還不十分清楚。實驗已經(jīng)證實,G蛋白偶聯(lián)受體119可以通過GLP-1受體途徑增強三磷酸腺苷結(jié)合盒A亞家族成員1(ABCA1)的表達,而且在THP-1源性巨噬細胞上用siRNA技術(shù)將GLP-1基因沉默,ABCA1的表達就顯著降低。ABCA1是高度保守的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族成員,在哺乳動物多種組織和細胞上都有表達。ABCA1在-些肺疾病中也發(fā)揮很大作用。實驗表明,在卵蛋白所激發(fā)的大鼠氣道炎癥反應(yīng)中,ABCA1在血管內(nèi)皮細胞上會出現(xiàn)過表達。根據(jù)以上研究進展,我們猜測GLP-1受體在COPD中起重要作用,而ABCA1又與GLP-1受體有關(guān)聯(lián)。為了驗證這些想法,我們分離了COPD患者的氣道平滑肌細胞,并且制作了和GLP-1、ABCA1有關(guān)的細胞模型,以尋找COPD患者氣道平滑肌上GLP-1受體可能的作用機制,證明GLP-1受體及ABCA1與氣道平滑肌細胞增殖、遷移及炎癥因子分泌有關(guān)系。第一部分GLP-1受體在氣道平滑肌細胞中的表達及其生物學(xué)作用的研究目的：本研究旨在探討GLP-1R在正常人和COPD患者氣道平滑肌細胞中的表達水平差異,進而揭示GLP-1R對氣道平滑肌細胞的生物學(xué)作用,為COPD疾病探尋新的治療靶點并提供新的理論依據(jù)。方法：以2014年3月至2015年9月期間南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院胸外科肺部手術(shù)患者為研究對象,正常肺組織取自無COPD病史的肺良性腫瘤患者,COPD肺組織取自行肺減容術(shù)的患者。COPD的診斷按照2013年中華醫(yī)學(xué)會公布的慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)科學(xué)委員會的診斷標(biāo)準(zhǔn),排除任何可能影響COPD病情的因素影響。用RT-PCR方法檢測正常人和COPD患者氣道平滑肌細胞GLP-1受體的mRNA表達水平差異。用Western blot方法檢驗上述兩組氣道平滑肌細胞GLP-1受體蛋白的表達水平。應(yīng)用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1受體過表達,應(yīng)用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受體表達下降。RT-PCR和Western blot方法檢測GLP-1受體過表達和沉默后GLP-1受體的表達水平。用MTT比色法觀察氣道平滑肌細胞增殖情況,用細胞遷移實驗觀察細胞遷移情況,用ELISA方法檢測不同處理組促炎因子IL-6、IL-8、TNFα和GM-CSF的表達水平。結(jié)果：1.一般資料：實驗標(biāo)本均取自于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院胸外科18例肺部手術(shù)患者(年齡：45-67歲),正常肺組織取自8例無COPD病史的肺良性腫瘤患者,COPD肺組織取自10例行肺減容術(shù)的患者。2.正常組和COPD組GLP-1R的表達比較：用RT-PCR和Western blotting檢測GLP-1受體mRNA和蛋白水平,發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比,COPD患者氣道平滑肌細胞中GLP-1的表達較低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.建立氣道平滑肌細胞GLP-1受體過表達和基因沉默的模型：用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1受體過表達,應(yīng)用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受體表達下降。用RT-PCR和Western blotting方法分別測量轉(zhuǎn)染后GLP-1受體表達的結(jié)果。pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1對照組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組GLP-1受體表達較高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。SiGLP-1R基因沉默組和SiMock對照組比較結(jié)果顯示SiGLP-1R基因沉默組GLP-1受體表達較低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。提示GLP-1受體過表達模型和基因沉默細胞模型均建立成功。4. COPD患者的各種氣道平滑肌細胞模型中細胞增殖和細胞遷移情況：GLP-1受體過表達模型與對照組比較,細胞增殖更少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GLP-1受體沉默細胞模型與SiMock組比較,細胞增殖多67%,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。細胞遷移實驗結(jié)果與細胞增殖結(jié)果基本一致。5.用酶聯(lián)免疫吸附法測COPD患者的各種氣道平滑肌細胞模型中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF的釋放：GLP-1受體過表達模型與對照組比較,炎癥因子釋放更少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GLP-1受體沉默細胞模型與SiMock組比較,炎癥因子釋放更多,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.GLP-1受體的表達在正常人和COPD患者氣道平滑肌細胞上有所不同,COPD患者GLP-1R表達較低,提示GLP-1受體可能參與了COPD的發(fā)生發(fā)展。2.GLP-1受體的過表達抑制了氣道平滑肌細胞的增殖和遷移,而其基因沉默加速了氣道平滑肌細胞的增殖和遷移。表明GLP-1受體的過表達可以減輕細胞增殖和遷移,因此它在COPD患者的氣道結(jié)構(gòu)重建中可能起重要作用。3.實驗數(shù)據(jù)也表明,GLP-1受體的過表達可以抑制IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF這些炎癥因子的釋放,而其基因沉默可以使上述炎癥因子的釋放增加。表明GLP-1受體的過表達可以減輕炎癥因子的釋放,因此它在COPD患者的炎癥反應(yīng)中可能起重要作用。第二部分關(guān)于ABCA1信號通路與GLP-1R關(guān)系的研究目的：研究ABCA1與GLP-1R的關(guān)系,求證GLP-1R/ABCA1信號通路,探討GLP-1R對氣道平滑肌細胞可能的作用機制。方法：首先,我們將COPD患者的氣道平滑肌細胞用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1受體過表達,應(yīng)用GLP-1R siRNA沉默基因使GLP-1受體表達下降。接著用RT-PCR和Western blot方法檢測ABCA1的基因及蛋白表達水平。第二步,我們再將COPD患者的氣道平滑肌細胞用pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染使GLP-1R過表達,應(yīng)用ABCA1 siRNA沉默基因使ABCA1表達下降。然后再用RT-PCR和Western blot方法檢測ABCA1的mRNA及蛋白表達水平。用MTT比色法觀察氣道平滑肌細胞增殖情況,用細胞遷移實驗觀察細胞遷移情況,用ELISA方法檢測不同處理組促炎因子IL-6、IL-8、TNFα和GM-CSF的表達水平。結(jié)果：1.GLP-1受體過表達和GLP-1受體沉默細胞模型中ABCA1的表達比較：用RT-PCR和Western bloting方法測定pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1對照組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R轉(zhuǎn)染組ABCA1表達較高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。SiGLP-1R基因沉默組和SiMock對照組比較結(jié)果顯示SiGLP-1R基因沉默組ABCA1表達較低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2. ABCA1沉默細胞模型中ABCA1的表達情況：用RT-PCR方法測定SiABCA1基因沉默組和SiMock對照組比較結(jié)果顯示SiABCA1基因沉默組ABCA1表達較低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。提示COPD患者支氣管平滑肌細胞的ABCA1基因沉默細胞模型建立成功。3. COPD患者的各種氣道平滑肌細胞模型中細胞增殖和細胞遷移情況：pcDNA3.1-GLP-1R組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R組細胞增殖、遷移更少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1 R+SiMock組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock組細胞增殖、遷移更少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1組與pcDNA3.1-GLP-1R組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1組細胞增殖、遷移更多,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果表明,抑制ABCA1可以阻止COPD患者支氣管平滑肌細胞上GLP-1受體過表達所引起的抑制細胞增殖、遷移作用。4.用酶聯(lián)免疫吸附法測COPD患者的各種氣道平滑肌細胞模型中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α和GM-CSF的釋放：pcDNA3.1-GLP-1R組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R組的炎癥因子釋放更少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock組與pcDNA3.1組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiMock組的炎癥因子釋放更少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCA1組與pcDNA3.1-GLP-1R組比較結(jié)果顯示pcDNA3.1-GLP-1R+SiABCAl組的炎癥因子釋放更多,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果表明,ABCA1基因沉默還可以阻止GLP-1受體過表達對IL-6、IL-8、 TNF-α和GM-CSF這些炎癥因子的釋放抑制作用。結(jié)論：1.GLP-1受體的過表達可以明顯上調(diào)ABCA1的表達,GLP-1受體的沉默也可以抑制ABCA1的表達,說明GLP-1受體表達與ABCA1表達水平之間有關(guān)系。2. ABCA1基因沉默后可以影響GLP-1受體對支氣管平滑肌細胞的增殖、遷移及細胞因子釋放等作用。說明GLP-1受體所介導(dǎo)的抑制細胞增殖、遷移,抑制炎癥因子釋放等作用都是有賴于ABCA1的表達,這些都證明ABCA1在氣道炎癥反應(yīng)中有重要作用。我們可以認為GLP-1R/ABCA1通路可能存在。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563.9

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3 張筱娟;蔡開勇;鄧林紅;;氣道平滑肌細胞的三維培養(yǎng)和生物力學(xué)研究[A];第九屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

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本文編號：1278749