本文關鍵詞：LOX在百草枯致肺纖維化過程中上皮向間質轉化中的作用

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【摘要】：百草枯(Paraquat,PQ)中毒是發(fā)展中國家急性中毒患者死亡的主要原因。肺是其主要靶器官,PQ中毒后,迅速在肺內積聚,導致肺泡上皮細胞滲透性增加,肺出血、水腫,引起急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合癥,進一步發(fā)展為肺纖維化,肺纖維化是PQ中毒導致死亡的主要原因。PQ中毒沒有特殊解毒藥物,因此研究百草枯導致的肺纖維化的機制具有重要意義。肺纖維化的主要病理特征是肺泡結構破壞,功能喪失,成纖維細胞和肌成纖維細胞增殖及細胞外基質沉積(extracellular matrix,ECM)。在肺纖維化的過程中,分泌細胞外基質的主要是肌成纖維細胞。肌成纖維細胞主要有3個來源,間質內的成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞;骨髓干細胞轉化為肌成纖維細胞;肺泡上皮細胞向間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。研究表明EMT是肺纖維化中肌成纖維細胞的重要來源,目前大量的實驗關注EMT在纖維化疾病中的研究。在ECM的沉積中起重要作用的是賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX),LOX是一種銅依賴性氨基酸氧化酶,通過催化細胞外的膠原蛋白和彈性蛋白特定位置的賴氨酰殘基氧化脫氨,引起分子內和分子間的共價交聯(lián),從而形成穩(wěn)定的不溶性的ECM,在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。另外,大量的研究越來越重視LOX在細胞內的功能并提出LOX可能在EMT過程中發(fā)揮作用。我們之前的研究表明EMT在PQ誘導的肺纖維化中發(fā)揮重要作用,因此我們推斷LOX是否在PQ導致的肺纖維化的EMT中發(fā)揮作用。論文主要探討LO X在PQ中毒后導致的肺纖維化過程中與EMT的關系。本課題進行了以下研究:1.觀察百草枯中毒后LOX表達、肺纖維化及EMT的情況(1)制備PQ中毒大鼠模型,蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色評估肺組織病理學改變;免疫組化和Western Blot檢測肺組織中LOX蛋白表達;Western Blot檢測肺組織中EMT上皮標志蛋白ZO-1、E-cadherin和間質標志α-SMA、Vimentin蛋白表達。(2)制備PQ中毒體外模型,采用不同濃度的PQ處理RLE-6TN和A549細胞24h,觀察細胞形態(tài)變化;采用Western Blot檢測細胞上皮和間質蛋白表達變化。2.LOX在百草枯致肺纖維化過程中EMT的作用(1)制備PQ中毒大鼠模型,采用LOX抑制劑BAPN腹腔內注射處理動物后PQ染毒;蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色評估肺組織病理學改變;免疫組化和Western Blot檢測肺組織中LO X蛋白表達;Western Blot檢測肺組織中上皮標志物、間質標志物的表達。(2)制備PQ中毒體外模型,采用LOX抑制劑BAPN處理細胞后再PQ染毒;觀察細胞形態(tài);Western Blot檢測細胞中LOX、上皮標志物和間質標志物的表達。(3)制備PQ中毒體外模型,體外采用LOX基因沉默(si RNA)沉默LOX基因再進行PQ處理;觀察細胞形態(tài)的變化;Western Blot檢測細胞中LOX表達;Western Blot和免疫熒光檢測細胞中上皮標志物和間質標志物的表達。主要研究結果如下:1.HE和Masson染色顯示PQ染毒72 h后大鼠肺內大量炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積;免疫組化和Western Blot結果顯示大鼠染毒72 h后肺組織內LOX增高;EMT上皮標志蛋白ZO-1和E-cadherin在大鼠中毒72 h后表達減少,間質標志α-SMA和Vimentin蛋白表達增強。這一結果提示PQ中毒后大鼠肺纖維化早期即發(fā)生,并伴隨LOX表達升高及EMT的發(fā)生。2.獲得PQ誘導上皮間質轉化的體外模型,PQ對細胞存活率的影響具有濃度依賴性,RLE-6TN細胞在PQ濃度為80μmol/L時存活率為47.88%,A549細胞在PQ濃度800umol/L時生存率為54.96%,我們以此濃度建立RLE-6TN和A549細胞PQ中毒的模型。3.PQ處理A549和RLE-6TN細胞24 h后,細胞由圓形或卵圓形變成長梭形,LOX蛋白表達增加,EMT的上皮標志E-cadherin和ZO-1表達降低,間質標志α-SMA和Vimentin表達升高,細胞發(fā)生了EMT。4.應用LOX的抑制劑BAPN抑制大鼠LOX蛋白活性,再進行PQ處理,肺損傷及纖維化的程度減弱,EMT的程度也減弱。5.應用LOX的抑制劑BAPN抑制RLE-6TN和A549細胞LOX蛋白活性,再進行PQ處理,EMT的程度減弱;且減弱程度隨抑制劑的濃度增加而增強。6.si RNA沉默A549細胞LOX基因后,再進行PQ處理24 h,發(fā)現(xiàn)A549細胞EMT的程度被減弱。7.單純用抑制劑BAPN處理RLE-6TN和A549細胞和大鼠肺組織后,細胞形態(tài)沒有發(fā)生變化,但EMT標志蛋白ZO-1和E-cadherin升高,間質標志α-SMA和Vimentin水平降低,類似于細胞發(fā)生了“間質向上皮的轉化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)”基于以上結果我們推測,在PQ誘導的肺纖維化過程中,LOX的表達可以促進EMT的進展,抑制LOX的活性,EMT的程度被減弱。本項目通過研究LOX及EMT在PQ誘導肺纖維化中的作用及機制,為尋找干預PQ所致早期肺纖維化的分子靶點提供理論和實驗依據(jù),為探討PQ治療手段提供了新的思路。LOX與EMT的關系可能會成為治療肺纖維化的潛在靶點。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R595.4;R563

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本文編號：1233784