本文關(guān)鍵詞：丹參酮ⅡA對大鼠肺間質(zhì)纖維化的保護作用及機制研究

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【摘要】：特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)是一種慢性、進展性、致死性，自診斷后中位生存時間少于3年的疾病，已成為呼吸系統(tǒng)疾病中嚴重威脅人民健康的重大疾病，目前發(fā)病機制尚不十分清楚，尚無有效治療方法。近十年來，有關(guān)IPF的臨床試驗活動呈指數(shù)增長，眾多學者對此病的重視，解決之迫切可見一斑。IPF不僅在發(fā)生環(huán)節(jié)其病因譜極為廣泛和復雜，同時在進展過程中存在多個病理生理過程參與、多個信號通路活化，是免疫紊亂、炎癥、纖維化的交織和不斷進展的過程。近年來，大多數(shù)學者把多種原因引起的肺臟損傷作為研究IPF的出發(fā)點，同時在體內(nèi)外實驗中應(yīng)用組織病理學及多種檢測技術(shù)觀察到在IPF病變的初期，是以下呼吸道急性炎癥反應(yīng)為主，包括中性粒細胞、單核巨噬細胞等炎癥細胞浸潤聚集，分泌多種具有生物活性的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白介素（IL-1β和IL-6）等，同時又可刺激產(chǎn)生眾多氧化產(chǎn)物，最終導致肺泡結(jié)構(gòu)的紊亂，肺實質(zhì)損傷，膠原纖維成分在間質(zhì)內(nèi)聚集及慢性增生，導致肺間質(zhì)纖維化。 近年來越來越多的證據(jù)也表明氧化應(yīng)激（氧化/抗氧化失衡）與特發(fā)性肺纖維化的形成和發(fā)展過程密切相關(guān)，同時肺臟在解剖學上的結(jié)構(gòu)位置及其主要的生理功能決定了肺是最易受到氧化應(yīng)激攻擊的靶器官之一。氧化應(yīng)激（Oxidative Stress）是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，氧化作用占優(yōu)勢，可導致中性粒細胞的聚集浸潤，分泌蛋白酶增加，產(chǎn)生許多的氧化中間產(chǎn)物，造成氧化損傷。正常情況下，機體內(nèi)存在著抗氧化系統(tǒng)，如酶系的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，這些抗氧化酶能對體內(nèi)產(chǎn)生的自由基作出迅速及時地調(diào)節(jié)，能把過多生成的自由基清除，以保證體內(nèi)氧化/抗氧化作用平衡，對機體有保護作用。但如果在一些不明原因的刺激因素下，體內(nèi)有超過清除能力的氧自由基生成，或者機體抗氧化能力下降，體內(nèi)SOD和GSH-Px的活性降低，就會致使相應(yīng)組織細胞的損傷，對肺臟而言，就會引起肺泡上皮細胞、內(nèi)皮細胞及肺臟間質(zhì)細胞等的損傷，引起這些細胞膜的脂質(zhì)成分發(fā)生過氧化作用。我們在實驗中也常用檢測氧化應(yīng)激過程中脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物丙二醛（MDA）的生成量來判斷體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用的程度，許多研究在體內(nèi)外實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)炎性刺激后動物體內(nèi)或細胞培養(yǎng)液中MDA的生成量增加也佐證了這一觀點，同時因自由基過多可損傷組織或細胞導致MDA的生成，是自由基生成情況的一個間接反映。同時，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡的另一種生物標記物--髓過氧化物酶（MPO），其水平也經(jīng)實驗證實在IPF患者的BALF中有明顯地升高。同時，在肺纖維化復雜病變的發(fā)生發(fā)展中，多種不明原因的刺激可使誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的活性被誘導，導致其合成的一氧化氮（NO）濃度較組成型NOS（constitutiveNOS，cNOS）的濃度明顯增高，可引起NO的產(chǎn)生增多。同時，在纖維化病變發(fā)展過程中，異常增多的炎性介質(zhì)可使體內(nèi)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的活性增強，產(chǎn)生前列腺素（prostaglandin，PG），尤其是PGE2增多，進而也會導致炎癥損傷，引起炎性循環(huán)。因此現(xiàn)使用抗氧化劑治療特發(fā)性肺纖維化也正在逐漸受到眾多專家和學者的重視和認同。 近年來，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)在肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用備受肯定，，TGF-β1可以促進成-肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化，而循環(huán)或肺組織中的成纖維細胞向肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化也是現(xiàn)階段肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機制中的研究熱點，已被眾多的學者認為是IPF發(fā)展過程中的重要病理過程，這種表型轉(zhuǎn)化在細胞實驗及動物組織病理學檢測中都已被觀察到。同時TGF-β1也可刺激許多種細胞及炎癥因子的合成、分泌，引起細胞外基質(zhì)沉積，其作用的實現(xiàn)是通過先與受體結(jié)合，而后主要通過下游的Smad2/3轉(zhuǎn)導通路完成的，而我們之前課題研究也已證實TGF-β1受體的I型受體中的活化素受體樣激酶5（activin receptor like kinase5，ALK5）在肺間質(zhì)纖維化過程中有明顯升高，這提示ALK5參與了肺間質(zhì)纖維化的發(fā)展。 醫(yī)學界關(guān)于IPF治療方法的研究一刻都沒有停止過，多年來，對于其治療方法經(jīng)歷了不同方向的探索，但由于IPF是一種病因及發(fā)病機制尚不十分明確的疾病，無法從根源著手去阻抑其發(fā)生發(fā)展，也無特效治療方法。2011年IPF的診治指南有了不同于2000年ATS/ERS共識的新意見，其將大多數(shù)治療措施改為不同強度的推薦意見，僅N-乙酰半胱氨酸、吡菲尼酮、抗凝藥物等少數(shù)藥物獲得“弱推薦”，主要因為它們有較好的安全性，同時少部分患者用藥治療后有部分療效。而糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑等藥物因其對機體有較大的不良作用，在臨床上的應(yīng)用有很大的局限性，因此，開發(fā)有效的藥物以控制肺間質(zhì)纖維化的病情，對于提高患者生活質(zhì)量或降低患者死亡率具有重要意義�，F(xiàn)代藥理學研究也證實多種中藥單體成分均有不同程度抑制肺纖維化的作用。丹參作為一種經(jīng)典傳統(tǒng)中藥，多年來被廣泛應(yīng)用于心血管病的治療中，而丹參酮IIA（Tanshinone IIA）是從丹參中提取出的脂溶性成分之一，是近年來國內(nèi)外學者對中藥單體中研究較多的活性成分，其在丹參酮中含量最高，也是最為穩(wěn)定的有效活性成分，其具有明確的分子結(jié)構(gòu)，已有實驗證實丹參酮IIA不僅具有清除氧自由基和抗炎的作用，且還具有抗腫瘤等多種藥學活性。同時，丹參酮IIA還具有多種肺保護作用。Wang等人的研究表明丹參酮IIA可以減輕博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化。然而，目前關(guān)于丹參酮IIA如何作用于肺間質(zhì)纖維化，其相關(guān)的具體生物學機制尚不十分清楚。 本課題擬采用氣管內(nèi)滴注博萊霉素的方法建立大鼠肺間質(zhì)纖維化模型，探討丹參酮IIA對大鼠肺間質(zhì)纖維化的保護作用及對炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響，并進一步探討其對肺間質(zhì)纖維化相關(guān)分子作用機制的影響。 第一部分丹參酮ⅡA對肺間質(zhì)纖維化大鼠組織形態(tài)學變化的影響 目的：探討丹參酮IIA對大鼠肺纖維化組織形態(tài)學變化的影響，以明確丹參酮IIA對肺間質(zhì)纖維化有無保護作用。 方法：清潔級SD大鼠，體重200-220g，雌雄不限，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組（N組），丹參酮IIA組，纖維化組（模型組），丹參酮IIA+纖維化組，每組6只。各組干預28天，然后收集各組肺泡灌洗液后，處死所有大鼠，取肺組織，對肺組織進行石蠟包埋后行組織病理學檢測，并計算肺組織的濕/干重比。 結(jié)果：經(jīng)丹參酮IIA干預性治療的丹參酮IIA+纖維化組大鼠的肺濕/干重比明顯低于纖維化模型組，病理組織學可見肺泡間隔纖維增生灶較少，累及病變范圍較小，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較少，膠原總含量減少。 結(jié)論：丹參酮IIA能降低肺間質(zhì)纖維化大鼠細胞外基質(zhì)的含量，減輕肺間質(zhì)纖維化的程度，對肺間質(zhì)纖維化有一定的保護作用。 第二部分丹參酮ⅡA對肺間質(zhì)纖維化大鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響 目的：觀察丹參酮IIA對炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響，進一步探討丹參酮IIA改善肺間質(zhì)纖維化的作用機制。 方法：清潔級SD大鼠，體重200-220g，雌雄不限，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組（N組），丹參酮IIA組，纖維化組（模型組），丹參酮IIA+纖維化組，每組6只。各組干預28天，收集各組大鼠肺泡灌洗液后處死，取肺組織，通過檢測各組大鼠肺泡灌洗液中總蛋白含量、總細胞數(shù)，對中性粒細胞，巨噬細胞計數(shù)觀察，ELISA檢測各組大鼠BALF中相關(guān)炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達水平，來探討丹參酮IIA對肺炎癥細胞及細胞因子的影響，通過試劑盒方法檢測各組大鼠肺組織中的MDA含量、MPO的活性及NO和PGE2含量，運用實時熒光定量PCR及western blot技術(shù)檢測各組大鼠肺組織中iNOS和COX-2的表達水平。 結(jié)果：經(jīng)博萊霉素干預28d后，纖維化模型組大鼠BALF中的總蛋白含量、總細胞數(shù)及中性粒細胞、巨噬細胞數(shù)量明顯增加，同時炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也顯著增加，肺組織內(nèi)MDA的含量和MPO的活性較正常對照組明顯增加或增強，同時也伴隨有NO的過量產(chǎn)生和PGE2的增多。免疫印跡結(jié)果和實時熒光定量PCR結(jié)果顯示在蛋白水平和mRNA水平上，iNOS和COX-2的表達量也是較正常對照組顯著增加的。但在丹參酮IIA干預性治療組，上述炎癥細胞和炎癥因子及產(chǎn)物明顯降低或減少，這進一步解釋了丹參酮IIA對肺間質(zhì)纖維化的保護作用機制。 結(jié)論：丹參酮IIA可通過降低肺間質(zhì)纖維化過程中的炎癥細胞和炎癥反應(yīng)因子，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低iNOS和COX-2的表達，使肺纖維化緩解或減輕。 第三部分丹參酮ⅡA對肺間質(zhì)纖維化大鼠TGF-β1/ALK5/Smad2/3傳導通路的影響 目的：進一步探討丹參酮IIA的保護作用是否與其抑制TGF-β1/ALK5/smad2/3信號轉(zhuǎn)導通路的某個環(huán)節(jié)有關(guān)，為丹參酮IIA應(yīng)用于治療肺間質(zhì)纖維化提供更多的理論基礎(chǔ)。 方法：清潔級SD大鼠，體重200-220g，雌雄不限，采用隨機數(shù)字表法分為對照組（N組），丹參酮IIA組，纖維化組（模型組），丹參酮IIA+纖維化組，每組6只。各組干預28天，然后收集各組肺泡灌洗液后，處死所有大鼠，取肺組織，結(jié)合前期組織病理改變，應(yīng)用ELISA，免疫印跡技術(shù)檢測TGF-β1、ALK5和Smad2/3的表達。 結(jié)果：在氣管內(nèi)滴注博萊霉素造模28d后，纖維化模型組大鼠血清及組織中的TGF-β1、ALK5及Smad2/3明顯增加，與正常對照組相比，其差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），而在應(yīng)用丹參酮IIA干預性治療后，大鼠血清TGF-β1水平下降顯著，同時ALK5及Smad2/3表達量也明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結(jié)論：丹參酮IIA可以抑制博萊霉素致肺間質(zhì)纖維化大鼠中TGF-β1/ALK5/Smad2/3致纖維化信號通路。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563

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本文編號：1209844