本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化治療的研究

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【摘要】：1.研究背景和目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多向分化潛能,能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生。BMSCs在骨髓中含量極低,而組織工程需要大量的種子細(xì)胞,從動(dòng)物骨髓分離BMSCs的難度在很大程度上限制了許多實(shí)驗(yàn)的開展。因此,建立一種持續(xù)、穩(wěn)定、可多向分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系對(duì)細(xì)胞的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)及組織工程至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)擬通過分離、培養(yǎng)、純化SD大鼠BMSCs,誘導(dǎo)其向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化,并對(duì)其細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行初步鑒定,希望建立一種理想的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增體系,為組織工程尋找良好的種子細(xì)胞提供實(shí)踐基礎(chǔ)。2.材料和方法2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)：取6-8周齡SD大鼠10只,清潔級(jí),大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,75%酒精浸泡10分鐘。無菌條件下取下脛骨及股骨,PBS液洗3次。剪去脛骨和股骨的干骺端,暴露骨髓腔,用無菌PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔；將沖出的骨髓制成單細(xì)胞懸液,1200rpm離心5分鐘,棄去上清,重懸,以3-4× 105個(gè)細(xì)胞/cm2接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中,然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2 BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代：原代培養(yǎng)過程中,48-72小時(shí)全量更換培養(yǎng)液,以后每隔2-3天更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿瓶底至細(xì)胞融合成單層,長至80%-90%密度融合時(shí),用0.25%胰酶消化,按照1：2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2.3 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況,拍照記錄。2.4 BMSCs的鑒定2.4.1 BMSCs的定向誘導(dǎo)分化：選擇P3代BMSCs,于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種BMSCs(5×103個(gè)細(xì)胞/cm2),待細(xì)胞貼壁生長至密度達(dá)80%時(shí),加入成骨或成脂細(xì)胞誘導(dǎo)液,每2-3天換液1次,以未加誘導(dǎo)液的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為對(duì)照。分別在誘導(dǎo)的第21天和第14天,對(duì)誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分別行茜素紅和油紅O染色。2.4.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物：收獲生長狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞,0.25%胰酶消化,1200rpm離心5分鐘,PBS液洗滌細(xì)胞2次,重懸,計(jì)數(shù)細(xì)胞,各管分別加入CD29、CD90、CD34單克隆抗體,同時(shí)每管樣品設(shè)立同型陰性對(duì)照。室溫避光孵育30分鐘,PBS液洗滌去除未結(jié)合抗體,再用PBS液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。3.研究結(jié)果3.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后,細(xì)胞呈圓型,大小不一,懸浮于培養(yǎng)液中。24小時(shí)后部分細(xì)胞開始貼壁生長,呈圓形、梭形或多角形。通過換液去除未貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞。48-72小時(shí)后可見放射狀排列的細(xì)胞集落,梭形細(xì)胞為主。3-5天后細(xì)胞呈集落生長,融合80%-90%。12-14天細(xì)胞排列緊密,逐漸融合成片。消化傳代后,傳代細(xì)胞24小時(shí)完全貼壁生長。細(xì)胞呈梭形生長,生長旺盛。4-5天傳代1次,可穩(wěn)定連續(xù)傳代10代以上,細(xì)胞形態(tài)及生長速度無明顯變化。3.2 BMSCs成骨誘導(dǎo)分化鑒定大鼠P3代BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第21天行茜素紅染色,可見紅染的鈣結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)中心透光度較差,四周輪廓模糊,呈淡紅色的暈輪區(qū)。3.3 BMSCs成脂誘導(dǎo)分化鑒定大鼠P3代BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第14天,細(xì)胞內(nèi)脂滴大量形成、合并呈串珠狀。油紅O染色為陽性,細(xì)胞內(nèi)脂滴呈橘紅色。3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果培養(yǎng)的P3代大鼠BMSCs均一表達(dá)CD29,CD90,陽性率分別為93.160%，，86.94%；而CD34呈陰性表達(dá),陽性率分別為1.65%和1.57%。4.結(jié)論本研究采用全骨髓貼壁法結(jié)合密度梯度離心法分離的大鼠BMSCs在形態(tài)學(xué)與生長動(dòng)力學(xué)上均符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。在成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,分別出現(xiàn)成骨、成脂表型特征,說明其可向這兩種細(xì)胞分化,并通過細(xì)胞表達(dá)一些特異性表面抗原,證實(shí)了本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性,獲得了數(shù)量足、純度高、增殖能力強(qiáng)且生物學(xué)特征穩(wěn)定的BMSCs,為組織工程提供充足的種子細(xì)胞打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。第二部分博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立方法及比較1.研究背景和目的肺纖維化(PF)的病理特點(diǎn)為肺部炎癥導(dǎo)致肺泡反復(fù)、持續(xù)性損傷及細(xì)胞外基質(zhì)反復(fù)破壞、修復(fù)和過度沉積。該病預(yù)后極差、嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量,病程一般呈進(jìn)行性發(fā)展,最終引起呼吸功能衰竭而死亡。近年來,PF的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。由于該病發(fā)病機(jī)制尚不清楚,臨床上缺乏有效的治療方法,病死率較高,因此建立可靠而穩(wěn)定的PF動(dòng)物模型是探索其發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效治療藥物的重要保障。目前用于復(fù)制PF模型所采用的動(dòng)物主要是嚙齒類動(dòng)物。常用的PF誘導(dǎo)劑主要包括博萊霉素(BLM)。用BLM制作的肺纖維化模型,其生理學(xué)改變和病理組織學(xué)變化與人類PF近似,因此成為復(fù)制PF模型的常用藥物。目前,采用不同方式、不同動(dòng)物經(jīng)多種途徑給藥建立的PF模型逐漸增多,均可成功建立PF模型。但是,不同給藥方法所致模型的病理改變與人的病理變化及病變部位卻不很相符,如何改進(jìn)方法促使模型病變部位接近人類是亟待解決的重要問題。本研究擬選用BLM作為誘導(dǎo)劑,分別經(jīng)腹腔、氣管給藥誘導(dǎo)大鼠發(fā)生PF,動(dòng)態(tài)觀察兩種大鼠PF模型肺組織形態(tài)學(xué)與羥脯氨酸含量等的變化,以探討一種更近似于人類PF病程的動(dòng)物模型建立方法。2.材料和方法健康雄性SD大鼠80只,分別經(jīng)氣管、腹腔給予BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化。隨機(jī)分為①氣管給藥模型組(model A):一次性氣管內(nèi)注入博萊霉素(5mg/kg),分別于給藥后第7、14、21天活殺10只,為model A7、modelA14、model A21組；②氣管給藥對(duì)照組(control A):大鼠在相同條件下經(jīng)氣管注入等量生理鹽水,余同model A組,于第21天活殺10只；③腹腔給藥模型組(]model B):大鼠每日左下腹腔注射博萊霉素(15mg/kg),連續(xù)5天。分別于給藥后第7、14、21天活殺10只,為model B7、model B14、model B21組；④腹腔給藥對(duì)照組(control B):每日腹腔內(nèi)給予等量生理鹽水,余同model B組,于第21天活殺10只。實(shí)驗(yàn)期間,每天觀察各組動(dòng)物的行為狀態(tài)并記錄體重變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取下雙側(cè)肺組織,測(cè)定肺組織濕干重比(W/D)；HE染色進(jìn)行肺組織病理學(xué)觀察及測(cè)定肺損傷定量評(píng)價(jià)指標(biāo)(IQA),CMIAS-B真彩色病理圖像分析系統(tǒng)在400倍下測(cè)定胸膜及肺泡間隔厚度；堿水法測(cè)定肺組織羥脯氨酸(HYP)含量；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定肺泡灌洗液TNF-α、IL-6的含量；免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-p)蛋白的表達(dá)水平。3.研究結(jié)果3.1各組大鼠起始體重并無差別。給予博萊霉素后,大鼠的體重值均有降低(P均0.01)。3.2與對(duì)照組相比,給藥大鼠W/D、IQA值均有升高(P均0.01)；腹腔給藥組與氣管給藥組相同時(shí)相點(diǎn)比較,W/D、IQA值明顯降低(P0.05或P0.01)。3.3肺組織羥脯氨酸(HYP)含量變化：兩種大鼠模型HYP含量均自第7、14天開始升高,第21天達(dá)高峰,腹腔給藥組大鼠HYP含量明顯高于氣管給藥組(P0.01)。3.4肺泡灌洗液檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組相比,各給藥組大鼠肺泡灌洗液中TNF-a與IL-6的含量均明顯增加(P0.05或P0.01),且隨時(shí)間的延長含量也逐漸增多。與氣管給藥組相同時(shí)相點(diǎn)比較,腹腔給藥組肺組織TNF-a與IL-6的含量明顯上調(diào)(P0.05或P0.01)。3.5免疫組織化學(xué)結(jié)果：與對(duì)照組相比,給藥組大鼠肺小靜脈TGF-β的含量均明顯增加(P0.01),且隨時(shí)間的延長TGF-β的含量也逐漸增多(P0.01),至給藥后第21天達(dá)高峰。與氣管給藥組相同時(shí)相點(diǎn)比較,腹腔給藥組肺小靜脈TGF-β蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.05),陽性細(xì)胞主要分布于肺泡上皮細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。3.6肺組織切片HE染色光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組大鼠肺泡壁完整,肺泡間隔未增厚；BLM處理組第7天可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,組織水腫；第14天肺泡間隔增寬,結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)纖維化病灶；第21天肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積,形成廣泛纖維化。氣管給藥組大鼠肺泡壁厚度較腹腔給藥組大鼠增厚明顯(P0.05)；腹腔給藥組大鼠胸膜較氣管給藥組明顯增厚(P0.01)。3.7肺組織切片電鏡下肺組織超微結(jié)構(gòu)顯示,BLM處理組肺微小動(dòng)脈,微小靜脈及毛細(xì)血管的內(nèi)皮和基底膜有不同程度的損害；肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞均有不同程度的損傷。3.8肺組織HYP與W/D、IQA之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.418,0.849,P均0.01)；HYP與TNF-α、IL-6和TGF-β蛋白之間亦存在非常顯著的正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.833,0.882,0.861,P均0.01)。4.結(jié)論4.1本研究分別通過氣管和腹腔給予BLM,可致大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞,呈現(xiàn)典型的肺纖維化病變,兩種給藥方法均可成功制備博萊霉素致大鼠PF動(dòng)物模型。4.2 BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化過程中,可能通過促進(jìn)肺組織中TNF-α、IL-6和TGF-β的產(chǎn)生,引起炎癥介質(zhì)對(duì)支氣管肺泡上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和異常修復(fù),破壞肺泡-毛細(xì)血管膜的完整性,刺激成纖維細(xì)胞異常增殖和膠原合成增加,從而促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)和肺纖維化的發(fā)病。4.3腹腔給藥具有操作快捷、簡便、死亡率低、個(gè)體間差異小等優(yōu)點(diǎn),可以降低因手術(shù)操作熟練程度不同而造成動(dòng)物纖維化程度的差異；且腹腔給藥引起膠原代謝紊亂程度重、形成的病變主要位于胸膜下,與人類IPF的影像學(xué)表現(xiàn)接近。腹腔內(nèi)給藥誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)生PF可能是較為理想的模型制作方法。第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化干預(yù)效應(yīng)的研究1.研究背景和目的特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種病因不明、以普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)為特征性病理改變的一種慢性、進(jìn)行性肺間質(zhì)疾病。該病進(jìn)行性加重,最終導(dǎo)致呼吸功能不全而死亡。臨床上除肺移植外尚無其它有效治療方法。但由于諸多因素限制,許多患者不能或不適合接受肺移植術(shù),故此方法實(shí)際難以在臨床上得到廣泛開展。因此,探索一種能在臨床具有實(shí)用前景的IPF治療方法具有重要意義。越來越多的研究表明氧化應(yīng)激與IPF的形成和發(fā)展有著密切關(guān)系。當(dāng)肺內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS時(shí)就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激,繼而引起不同程度的肺損傷。肺臟作為體內(nèi)最重要的器官之一,由于其獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)和外界相通的特性,決定了肺是體內(nèi)最易受到氧化應(yīng)激攻擊的靶器官。因此,研究氧化應(yīng)激致IPF的作用機(jī)制對(duì)于IPF的預(yù)防和治療具有重要意義。機(jī)體內(nèi)氧化還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎(chǔ)。Nrf2作為細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子,能夠激活機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答,保護(hù)細(xì)胞抵抗各種內(nèi)源性應(yīng)激和環(huán)境應(yīng)激。Nrf2如果出現(xiàn)功能障礙,可加重氧化應(yīng)激源的毒性,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)各種功能障礙甚至死亡。大量的研究證實(shí)Nrf2-ARE信號(hào)通路及其下游基因在抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮重要的保護(hù)功能。由此,我們提出如下假說：第一,Nrf2-ARE通路在保護(hù)肺組織細(xì)胞抵抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用；第二,IPF患者肺組織細(xì)胞中Nrf2-ARE通路可能存在異常,導(dǎo)致其對(duì)氧化應(yīng)激更為敏感。由于干細(xì)胞可能具有修復(fù)組織損傷的潛力,故而近年來干細(xì)胞療法成為PF治療中的一個(gè)熱門研究課題。本研究擬腹腔內(nèi)少量多次注射BLM制備PF動(dòng)物模型,通過尾靜脈輸注BMSCs,使其定植于受損肺組織,分別從動(dòng)物、器官、細(xì)胞及分子水平觀察BMSCs對(duì)PF的治療作用及其可能機(jī)制,為臨床防治IPF提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。2.材料和方法體外分離、培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,傳至第四代用于實(shí)驗(yàn)。40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：陰性對(duì)照組(Control組)、肺纖維化組(BLM組)、間充質(zhì)干細(xì)胞治療組(BLM+BMSC組)和間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)照組(BMSC組),每組各10只大鼠。BLM組每日左下腹腔內(nèi)注射博萊霉素(15mg/kg),連續(xù)5天,制備肺纖維化模型；BMSC+BLM組于博來霉素注射后立即經(jīng)尾靜脈注入大鼠BMSCs懸液(2×106/1.5m1),連續(xù)5天；BMSC組經(jīng)腹腔注入等量生理鹽水,余同BMSC+BLM組；Control組作為陰性對(duì)照,經(jīng)腹腔注入等量生理鹽水后,未給予其他處理。各組大鼠分別于造模后第21天處死。取肺組織檢測(cè)肺濕干重量比(W/D)；分別用HE染色和MASSON染色進(jìn)行肺組織病理學(xué)觀察；堿水法測(cè)定肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量；分別用硫代巴比妥酸(TBA)法、黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血漿丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力；Western-blot檢測(cè)肺組織中Nrf2、NQO1、HO-1、y-GCS蛋白的表達(dá)。3.研究結(jié)果3.1與Control組比較,BLM組和BLM+BMSC組W/D值和HYP含量明顯升高,有顯著性差異(P0.01)；與BLM組大鼠比較,BLM+BMSC組W/D值與HYP含量明顯降低(P0.01)。3.2 HE和MASSON染色顯示BMSCs顯著降低大鼠肺泡炎和肺纖維化的程度。3.3生化指標(biāo)檢測(cè)顯示：與Control組相比,BLM組大鼠血漿SOD活性顯著降低(P0.01),MDA含量顯著增高(P0.01)；與BLM組相比,間充質(zhì)干細(xì)胞治療組大鼠血漿SOD活性明顯上調(diào),MDA含量顯著降低(P0.01)。3.4 Western-blot結(jié)果顯示：與Control組比較,BLM組大鼠肺組織Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P均0.01)；與BLM組比較,BLM+BMSC組大鼠肺組織中Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)(P0.05或P0.01)。3.5相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Nrf2蛋白和NQO1、HO-1、γ-GCS蛋白存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.847,0.924,0.957,P均0.01)。4.結(jié)論4.1 BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中,氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),激活了機(jī)體內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路Nrf2-ARE。肺纖維化大鼠肺臟存在明顯的氧化應(yīng)激損傷和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。激活的Nrf2-ARE通路及下游Ⅱ相解毒酶HO-1、y-GCS和NQO1的表達(dá),發(fā)揮了內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激和解毒的功效。但是,這種代償保護(hù)作用非常有限,并不能徹底改變肺纖維化病程中氧化應(yīng)激狀態(tài)的存在。4.2 BMSCs的移植可顯著提高肺纖維化大鼠Nrf2的含量,進(jìn)而促進(jìn)下游保護(hù)性蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1的表達(dá),清除ROS,抑制肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng),由此減輕損傷肺組織中成纖維細(xì)胞的增生,對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化具有積極的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 誘導(dǎo)分化 大鼠 博萊霉素 肺纖維化 大鼠 氣管內(nèi)給藥 腹腔內(nèi)給藥 動(dòng)物模型 肺纖維化 Nrf2 氧化應(yīng)激 抗氧化酶BMSCs
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-23
• 前言23-26
• 第一部分 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定26-40
• 引言26-27
• 材料與方法27-32
• 結(jié)果32-36
• 討論36-38
• 第一部分小結(jié)38-40
• 第二部分 博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立方法及比較40-62
• 引言40-41
• 材料與方法41-46
• 結(jié)果46-56
• 討論56-61
• 第二部分小結(jié)61-62
• 第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化干預(yù)效應(yīng)的研究62-81
• 引言62-64
• 材料與方法64-69
• 結(jié)果69-75
• 討論75-80
• 第三部分小結(jié)80-81
• 全文總結(jié)81-83
• 參考文獻(xiàn)83-98
• 綜述98-121
• 參考文獻(xiàn)110-121
• 攻讀期間成果121-122
• 致謝122-123

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號(hào)：1126696