本文關(guān)鍵詞：COPD與上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)性研究

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【摘要】：目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是常見的呼吸系統(tǒng)慢性病,具有高患病率及高死亡率等特點,其發(fā)病機制復雜,可能與多個基因變異相關(guān),動物模型的建立與研究對了解其發(fā)病機制尤為重要。本研究旨在探索并構(gòu)建新的小鼠COPD模型,并從小鼠一般狀況、肺組織病理變化等多個方面對其進行評估。對上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標志物(E-cadherin、α-SMA及collagen I)在COPD模型組及對照組中表達情況進行觀察,并進行半定量PCR,初步篩選出與COPD相關(guān)的候選基因。在小鼠COPD模型、香煙煙霧提取物(CSE)刺激的人支氣管上皮細胞(16HBE)及相應對照組中通過定量PCR、Dot bolt、Western blot及免疫熒光等檢查,研究該候選基因在其中的表達情況;對myh14在COPD的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用進行探討,為將來進一步研究其在COPD中的具體作用機制打下基礎。方法:1、通過采用CSE聯(lián)合脂多糖(LPS)滴鼻建立小鼠COPD模型,將20只雄性C57/BL6小鼠隨機平均分為正常對照組及COPD模型組,于建模第42天同時處死小鼠,每組隨機選取6只小鼠進行后續(xù)實驗。2、觀察對照組及模型組的一般情況、肺組織病理變化(HE染色、PAS染色)、肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI),免疫組化觀察EMT表現(xiàn)。3、對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細胞分類計數(shù)觀察。4、用兩組小鼠肺組織作為標本進行半定量PCR初步篩選出與COPD相關(guān)的候選基因。5、用定量PCR、Dot blot檢測篩選出的候選基因(myh14)在小鼠肺組織中m RNA及蛋白表達水平。6、MTT法選擇細胞實驗中最適CSE刺激濃度,按CSE對細胞刺激的不同時間進行分組,用定量PCR及Dot blot檢測myh14在各組細胞中m RNA及蛋白表達水平,并通過免疫熒光法觀察各組細胞中myh14的分布與表達。7、Western blot檢測Collagen I及α-SMA在COPD模型組及對照組肺組織中的蛋白表達水平。8、COPD模型組進行myh14與E-cadherin、α-SMA、Collagen I之間相關(guān)性分析。結(jié)果:1、一般情況:觀察兩組小鼠毛發(fā),活動等情況,COPD模型組小鼠較對照組出現(xiàn)活動減少,消瘦,呼吸困難等表現(xiàn),對照組小鼠存活率100%;模型組存活率為80%。2、肺組織病理學及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化:對照組氣道及肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰,較少炎性細胞浸潤,肺泡間隔無明顯增厚及斷裂出現(xiàn)。模型組氣道上皮結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)黏液高分泌,肺泡壁斷裂并融合成肺大泡,有較多炎性細胞浸潤。模型組MLI及DI均較對照組升高(P0.05)。3、BALF細胞分類計數(shù):COPD模型組BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞比例均較對照組升高(P0.05)。4、免疫組化及相關(guān)性分析:對照組氣道上皮細胞結(jié)構(gòu)完整,胞漿內(nèi)可見大量myh14陽性表達,而模型組myh14表達減少(P0.05);模型組E-cadherin較對照組減少(P0.05);模型組氣道平滑肌增生較對照組明顯;模型組氣道壁膠原沉積明顯,Collagen I表達較對照組增多(P0.05)。模型組氣道上皮myh14、E-cadherin平均光密度值(IOD/area)較對照組減少(P0.05),模型組Collagen I平均光密度值(IOD/area)較對照組升高(P0.05)。平均光密度值相關(guān)性分析顯示模型組myh14與E-cadherin呈正相關(guān)(r=0.967,P0.01),與Collagen I呈負相關(guān)(r=-0.925,P0.01)。5、半定量PCR篩選COPD相關(guān)候選基因結(jié)果:經(jīng)過對兩組小鼠肺組織進行半定量PCR COPD相關(guān)候選基因篩選,發(fā)現(xiàn)Slc9a2、Foxj1及Gif在兩組中差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),Chrm1、Sprr2b、Rag1、Dusp5、Cldn2、Cldn22、Scin差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),Morc3、Rela、Akt1、Pik3r1、IL6ra、Myh14、Tpm3、Crabp2、Sprr2a2、Lyn、Srrm4、C/EBP、Gabarap、Elk1、Hk2、Tjap1、Strada兩組間有明顯差異(P0.01),選取差異明顯的myh14作為COPD相關(guān)基因進行后續(xù)實驗。6、CSE細胞毒性試驗:對不同CSE濃度刺激24h的16HBE細胞進行MTT法檢測各組細胞活性,在CSE濃度≤2.5%時,細胞活性降低不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),當CSE濃度大于2.5%時,細胞活性出現(xiàn)明顯下降(P0.01)。故選用2.5%CSE進行后續(xù)細胞實驗。7、實時熒光定量PCR:myh14在小鼠COPD模型組中相對m RNA含量(RQ值)較對照組下降(P0.05),CSE對16HBE細胞不同時間刺激(8h、24h)組中myh14m RNA水平均較對照組下降(P0.01),CSE 8h及24h刺激組間存在差異,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。8、Dot blot、Western blot結(jié)果及相關(guān)性分析:Dot blot結(jié)果顯示,COPD模型組myh14蛋白表達水平較對照組下降(P0.05),Western blot結(jié)果顯示模型組中α-SMA及collagen I蛋白表達水平均較對照組升高(P0.05);相關(guān)性分析顯示模型組中蛋白表達水平上myh14與α-SMA呈負相關(guān)(r=-0.833,P0.05),與collagen呈負相關(guān)(r=-0.953,P0.01)。16HBE細胞經(jīng)CSE刺激(8h、24h)后,Dot blot顯示myh14在蛋白表達水平上均較對照組明顯下降(P0.01),CSE 8h及24h刺激組間存在差異性,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。9、16HBE細胞中myh14免疫熒光檢測:綠色熒光為myh14在細胞中的陽性表達,myh14表達于細胞胞漿內(nèi),CSE刺激組(8h,24h)較對照組熒光表達明顯減弱(P0.01),不同CSE刺激組間存在差異,且差異存在統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1、CSE聯(lián)合LPS滴鼻可成功構(gòu)建小鼠COPD模型。2、COPD中存在EMT現(xiàn)象的發(fā)生。3、myh14可在人支氣管上皮細胞及小鼠支氣管上皮細胞表達,且在小鼠COPD模型及經(jīng)CSE刺激的16HBE細胞中存在m RNA及蛋白水平下降。4、myh14可能在COPD發(fā)生EMT中起著重要作用,上調(diào)myh14的藥物或許能抑制EMT的發(fā)生,這使得myh14可能會成為COPD等疾病藥物治療的新靶點。
【關(guān)鍵詞】：COPD 動物模型 myh14 EMT CSE
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 中文摘要3-7
• 英文摘要7-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-36
• 結(jié)果36-60
• 討論60-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻67-71
• 英漢縮略詞對照表71-72
• 致謝72-73
• 上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與慢性阻塞性肺病的研究進展（綜述）73-85
• 參考文獻79-85

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