本文關(guān)鍵詞：CD147通過非依賴p53途徑促進卵巢癌細胞糖代謝重編程的機制研究

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【摘要】：能量代謝異常是腫瘤細胞的基本特征,在腫瘤發(fā)生與演進中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。糖代謝重編程是腫瘤細胞能量代謝失調(diào)的主要方面,在生物合成與氧化還原反應(yīng)中提供能量和物質(zhì)前體,但腫瘤細胞這種低效供能方式的分子機制尚不明確。既往研究表明,CD147通過p53途徑促進人肝癌細胞糖酵解與增殖。p53失活是人類惡性腫瘤細胞中的普遍現(xiàn)象,約60%的卵巢癌患者存在p53突變。然而,CD147能否通過非依賴p53途徑促進卵巢癌細胞糖代謝重編程及其具體的分子機制尚不明確。本課題在既往研究基礎(chǔ)上,借助p53缺失型卵巢癌細胞系,深入研究CD147參與卵巢癌細胞糖代謝重編程的生物學(xué)作用,系統(tǒng)分析CD147通過非依賴p53途徑促進卵巢癌細胞有氧糖酵解的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制。這些研究可進一步加深對卵巢癌能量代謝異常的理解,也為CD147作為卵巢癌治療靶點提供更為豐富的分子理論基礎(chǔ)。本研究主要分為以下三個部分第一部分:CD147通過非依賴p53途徑促進卵巢癌細胞糖酵解的作用研究為闡明CD147在卵巢癌細胞糖代謝過程中的作用,我們構(gòu)建了穩(wěn)定干涉CD147的卵巢癌細胞系。我們發(fā)現(xiàn)無論是在p53野生型的A2780細胞中,還是在p53缺失型的SKOV3細胞中,干涉CD147的表達均會降低細胞糖攝取、糖酵解速率和乳酸排出,而氧消耗則有所升高。小動物PET/CT成像系統(tǒng)顯示干涉CD147的表達會顯著降低裸鼠移植瘤的18F-FDG攝取能力,且移植瘤的細胞增殖速度有所降低�？傊�,我們的實驗結(jié)果表明CD147具有促進卵巢癌細胞糖酵解的作用,并有可能成為基于能量代謝失調(diào)的靶點,從而制定新的抗腫瘤策略。第二部分:CD147在卵巢癌細胞中調(diào)控FOXM1的機制研究為明確CD147促進卵巢癌細胞糖酵解的分子機制,我們使用shRNA技術(shù)在卵巢癌細胞A2780和SKOV3中干涉了CD147的表達。Western blot結(jié)果顯示,在卵巢癌細胞A2780和SKOV3中下調(diào)CD147會明顯降低CD147,pAKT、pSTAT3和FOXM1的表達。Real time PCR結(jié)果顯示,在卵巢癌細胞A2780和SKOV3中下調(diào)CD147會明顯降低FOXM1 mRNA的表達水平。另一方面,AKT抑制劑LY294002和STAT3抑制劑S3I-201在卵巢癌細胞中會顯著降低過表達CD147對FOXM1的上調(diào)作用。激光共聚焦成像結(jié)果顯示,CD147和CD44在卵巢癌細胞中共定位。通過免疫組織化學(xué)染色檢測,我們發(fā)現(xiàn)CD147、pAKT、pSTAT3和FOXM1在卵巢癌組織中共表達。第三部分:轉(zhuǎn)錄因子FOXM1促進卵巢癌細胞糖代謝重編程的機制研究我們首先篩選了轉(zhuǎn)錄因子FOXM1可能調(diào)控的糖酵解關(guān)鍵酶,在卵巢癌細胞中干涉FOXM1的表達后,發(fā)現(xiàn)GLUT1和HK2的表達水平也隨之下降,且細胞糖酵解和增殖明顯受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn),GLUT1和HK2的DNA啟動子序列存在轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的結(jié)合位點,FOXM1能在卵巢癌細胞中激活GLUT1和HK2的轉(zhuǎn)錄與表達。我們還發(fā)現(xiàn)FOXM1、GLUT1和HK2在卵巢癌組織中的表達水平遠高于正常卵巢組織,且FOXM1在卵巢癌組織中的表達分別與GLUT1和HK2的表達正相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 糖酵解 腫瘤代謝 CD147 FOXM1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-24
• 第一部分 CD147通過非依賴p53途徑促進卵巢癌細胞有氧糖酵解的作用研究24-43
• 1 材料24-27
• 1.1 主要儀器設(shè)備24-25
• 1.2 主要試劑和耗材25
• 1.3 細胞系25-26
• 1.4 實驗動物26
• 1.5 主要緩沖液26-27
• 2 方法27-37
• 2.1 細胞培養(yǎng)27
• 2.2 構(gòu)建穩(wěn)定干涉CD147的卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和SKOV327-28
• 2.3 Real Time PCR28-30
• 2.4 蛋白免疫印跡30-32
• 2.5 荷瘤小鼠模型的構(gòu)建32
• 2.6 細胞葡萄糖攝取檢測32
• 2.7 細胞糖酵解速率檢測32-33
• 2.8 細胞乳酸排出檢測33-34
• 2.9 細胞氧消耗速率檢測34
• 2.10 荷瘤小鼠~(18)F-FDG攝取率檢測34
• 2.11 免疫組織化學(xué)染色及評分34-37
• 2.12 統(tǒng)計學(xué)分析37
• 3 結(jié)果37-41
• 3.1 下調(diào)CD147能顯著抑制卵巢癌細胞糖酵解37-39
• 3.2 下調(diào)CD147能抑制裸鼠移植瘤的增殖39-41
• 4 討論41-43
• 第二部分 CD147在卵巢癌細胞中調(diào)控FOXM1的機制研究43-57
• 1 材料43-46
• 1.1 細胞系43
• 1.2 儀器設(shè)備43-44
• 1.3 試劑和耗材44-45
• 1.4 緩沖液45-46
• 2 方法46-49
• 2.1 Real Time PCR46
• 2.2 蛋白免疫印跡46-47
• 2.3 免疫熒光染色47-48
• 2.4 免疫組織化學(xué)染色及評分48-49
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析49
• 3 結(jié)果49-54
• 3.1 CD147能通過非依賴p53途徑調(diào)控FOXM1、HK2和GLUT1的表達49-51
• 3.2 CD147和CD44在卵巢癌細胞中發(fā)生共定位51-52
• 3.3 CD147、pAKT、p STAT3和FOXM1在卵巢癌組織中表達正相關(guān)52-54
• 4 討論54-57
• 第三部分 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1促進卵巢癌細胞糖代謝重編程的機制研究57-79
• 1 材料57-60
• 1.1 細胞系57
• 1.2 儀器設(shè)備57-58
• 1.3 試劑和耗材58-59
• 1.4 緩沖液59-60
• 2 方法60-69
• 2.1 構(gòu)建穩(wěn)定干涉FOXM1的卵巢癌細胞系60
• 2.2 Real Time PCR60-61
• 2.3 蛋白免疫印跡61-62
• 2.4 荷瘤小鼠模型的構(gòu)建62
• 2.5 細胞葡萄糖攝取檢測62-63
• 2.6 細胞糖酵解速率檢測63
• 2.7 細胞乳酸排出檢測63-64
• 2.8 細胞氧消耗檢測64
• 2.9 荷瘤小鼠~(18)F-FDG攝取率檢測64-65
• 2.10 染色質(zhì)免疫沉淀Ch IP65-67
• 2.11 雙熒光素酶報告基因檢測67-68
• 2.12 免疫組織化學(xué)染色及評分68
• 2.13 統(tǒng)計學(xué)分析68-69
• 3 結(jié)果69-77
• 3.1 下調(diào)FOXM1能顯著抑制卵巢癌細胞糖酵解69-70
• 3.2 GLUT1和HK2是FOXM1直接調(diào)控的糖酵解關(guān)鍵酶70-74
• 3.3 下調(diào)FOXM1能抑制裸鼠移植瘤的增殖74-75
• 3.4 FOXM1在卵巢癌組織中的表達分別與GLUT1和HK2的表達正相關(guān)75-77
• 4 討論77-79
• 小結(jié)79-80
• 參考文獻80-87
• 個人簡歷及研究成果87-88
• 致謝88-89

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