發(fā)布時(shí)間：2017-08-17 15:12

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的利用siRNA干擾人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在宮頸癌Caski細(xì)胞中的研究

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【摘要】：第一章hTERT基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[摘要]目的：構(gòu)建及鑒定攜帶沉默人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)慢病毒表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究hTERT基因在宮頸癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：以Designer3.0 ( Genepharma)軟件設(shè)計(jì)靶向hTERT基因特異性的小片段RNA (shRNA)干擾序列,將hTERT-shRNA基因片段插入重組慢病毒pGLV3/Hl/GFP+Puro,構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA測(cè)序驗(yàn)證hTERT片段準(zhǔn)確性。LV3-shRNA-hTERT與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,濃縮上清液并測(cè)定病毒滴度獲得重組慢病毒后感染caski細(xì)胞。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(未感染病毒的caski細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(感染空載病毒LV3-shNC的caski細(xì)胞)和hTERT干擾組(感染攜帶LV3-shhTERT慢病毒的caski細(xì)胞)。綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染結(jié)果并估計(jì)轉(zhuǎn)染效率,流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)病毒感染率,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后基因hTERT mRNA的表達(dá)量。結(jié)果：將目的序列成功連接到載體上,并經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)載體構(gòu)建成功；成功包裝成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宮頸癌caski細(xì)胞。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的hTERT-小片段干擾RNA慢病毒表達(dá)載體感染caski細(xì)胞后hTERT基因的表達(dá)量顯著低于空白組和對(duì)照組(P0.01)。結(jié)論：成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體LV3-siRNA-hTERT,能夠有效感染宮頸癌caski細(xì)胞,并使hTERTmRNA的表達(dá)量明顯降低,為進(jìn)一步探討hTERT基因在子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和體外基因干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。第二章hTERT基因?qū)m頸癌caski細(xì)胞生物學(xué)影響的體外研究[摘要]目的：探索宮頸癌caski細(xì)胞中hTERT基因表達(dá)下調(diào)之后對(duì)其生物學(xué)功能的影響。方法：CCK-8法檢測(cè)三組細(xì)胞(NC、NC-LV、sihTERT-LV)的生長(zhǎng)增殖情況,細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的單克隆能力,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：si-hTERT-LV組細(xì)胞生長(zhǎng)速度、單細(xì)胞克隆能力明顯低于NC組及NC-LV組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。si-hTERT-LV組G1期細(xì)胞比率明顯高于NC組和NC-LV組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05); si-hTERT-LV組S期細(xì)胞比率明顯低于NC組和NC-LV組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。si-hTERT-LV細(xì)胞凋亡率明顯高于NC-LV組和NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。結(jié)論：宮頸癌caski細(xì)胞沉默了hTERT基因后,明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),將細(xì)胞周期阻滯于GO/G1期,同時(shí)抑制其單克隆形成能力,增加細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：宮頸腫瘤 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因 慢病毒載體 小片段RNA caski細(xì)胞 宮頸癌 caski細(xì)胞 人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-7
• 英文縮略詞7-9
• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 第一章 hTERT基因的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定16-63
• 1. 前言16-17
• 2. 材料與方法17-48
• 2.1 材料17-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象17-18
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 2.1.3 主要溶液配制19-21
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器21-23
• 2.1.5 器具處理23
• 2.2 方法23-48
• 2.2.1 表達(dá)hTERT-shRNA的慢病毒載體構(gòu)建23-33
• 2.2.2 慢病毒包裝、濃縮、收集33-40
• 2.2.3 用構(gòu)建好的病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞40-42
• 2.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立42-43
• 2.2.5 實(shí)驗(yàn)分組43-44
• 2.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)hTERT mRNA水平的表達(dá)44-48
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法48
• 3. 結(jié)果與分析48-55
• 3.1 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果48-50
• 3.2 慢病毒滴度的測(cè)定50-51
• 3.3 干擾序列的抗性篩選及流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率51-52
• 3.4 總RNA完整性純度檢測(cè)52-53
• 3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)hTERT基因的變化53-55
• 4. 討論55-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 第二章 慢病毒介導(dǎo)的利用siRNA沉默hTERT基因?qū)m頸癌caski細(xì)胞生物學(xué)功能的影響63-90
• 1. 前言63-64
• 2. 材料與方法64-77
• 2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)儀器64-68
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象64
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑64-65
• 2.1.3 主要試劑的配置65-67
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器67-68
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)器具處理68
• 2.2 方法68-77
• 2.2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng)68-69
• 2.2.2 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)69-71
• 2.2.3 細(xì)胞增殖的CCK-8檢測(cè)71-73
• 2.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)周期的檢測(cè)73-76
• 2.2.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)76-77
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析77
• 3. 結(jié)果與分析77-84
• 3.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線77-79
• 3.2 細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-80
• 3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果80-82
• 3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果82-84
• 4. 討論84-86
• 參考文獻(xiàn)86-90
• 綜述90-102
• 參考文獻(xiàn)96-102
• 全文小結(jié)102
• 研究創(chuàng)新性總結(jié)102-103
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文103-104
• 致謝104-106
• 附件106-111

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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本文編號(hào)：689661