本文關(guān)鍵詞：DAZL和BOULE基因促進小鼠早期生殖分化的研究

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【摘要】：據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道,全球適齡里面有大約15%正在遭受不育不孕癥的困擾[1],而我國的調(diào)查報告顯示,約有10%的已婚夫婦患有不孕不育癥,也就是說平均每6對夫婦中就有一對沒有辦法有自己的孩子。更為嚴重的是,近年來的數(shù)據(jù)顯示,不育不孕癥的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。不孕不育癥的原因非常多,生殖細胞形成異常是其主要的原因之一。目前,臨床上對于不育不孕癥的治療主要采取輔助生殖的手段解決,但是對于某些精子發(fā)生障礙的患者,輔助生殖仍然沒有辦法幫助他們得到健康的子代[1,2]。但是,體細胞重編程(Somatic reprogramming)以及多能性干細胞(Pluripotency stem cells)向生殖細胞分化的技術(shù)對解決這個問題而言是一個有效的解決方法[1,3]。原始生殖細胞(Primordial germ cells, PGCs)是最早期的生殖細胞,能反映一種細胞的特征[4,5]。原始生殖細胞具有單能性,能夠分化到精子和卵細胞[4,6]。除此之外,原始生殖細胞在合適的培養(yǎng)環(huán)境中還能重新獲得類似于胚胎干細胞(Embryonic stem cells)的多能性[7-11]。哺乳動物原始生殖細胞特化是在胚胎發(fā)育過程中響應(yīng)特定的信號通路[12-23]下進行的。在胚胎7.25天,胚外外胚層組織分泌BMP信號通路相關(guān)的因子作用于外胚層細胞,進而這些細胞獲得發(fā)育到原始生殖細胞的命運。原始生殖細胞發(fā)育過程中,包括兩個主要的事件：一個是表觀的改變,包括全基因組的去甲基化和甲基化[24-34],印記的擦除和重新建立[35-37]；另一個是多能性的重新獲得。因此,對于原始生殖細胞既是研究體外生殖分化的重要對象,又是對表觀遺傳學等學科進行基礎(chǔ)研究的重要對象。目前對于原始生殖細胞的研究國際和國內(nèi)已經(jīng)取得了卓越的成績。目前,日本科學家Mitinori Saitou率領(lǐng)的小組建立了Blimp1-mVenus (BV)和Stella-ECFP(SC)雙標記的細胞系,能夠靈敏的指示原始生殖細胞的發(fā)育過程[1,3,38]；并且通過Bmp4和Bmp8a的誘導得到原始生殖細胞樣細胞,進一步分化分化可以得到單倍體精子細胞,通過單精子卵母細胞胞漿內(nèi)注射可以得到健康的后代；在此基礎(chǔ)上,通過過表達Blimp1,Prdm14, Tcfap2c三個生殖特化過程中所必須的基因可以獲得PGCLCs。然而,PGCLCs的數(shù)量缺乏仍然是在早期生殖分化進行表觀遺傳學和生化分析的瓶頸之一,因此,如何高效的獲得PGCLCs仍然是一個亟待解決的問題。DAZ (Deleted in Azoospermia)家族基因是在在生殖細胞中特異表達的基因家族[39,40],包括三個成員：DAZL, DAZ, BOULE.在小鼠基因組中,只存在位于常染色體上的DAZL和BOULE基因[39,41-43]。DAZ家族基因在蛋白結(jié)構(gòu)上有相同的機構(gòu),包括一個保守的RNA識別模塊(RNA recognition motif, RRM),以及由24個氨基酸殘基組成的DAZ模塊。DAZ家族基因主要作用mRNA的3'UTR區(qū)[39,44]。DAZL和BOULE的自然缺失和敲除實驗證明,DAZL和BOULE是生殖細胞分化必須的基因[45-48]。我們通過在已有建立的整合有Blimp1, Prdm14和Tcfap2c三個過表達基因的含有Blimp1-m Venus和Stella-ECFP報告基因的胚胎干細胞系的基礎(chǔ)上,建立了穩(wěn)定整合有DAZL和BOULE的小鼠胚胎干細胞系。體外早期生殖分化的研究顯示,過表達DAZL和BOULE能夠促進PGCLC的分化,并且特異基因也有逐步高表達的趨勢。小鼠DAZ家族基因可能是通過激活PGCs早期特異基因的表達從而提高PGCLCs的分化效率。本工作揭示DAZL和BOULE基因在早期生殖細胞特化過程中具有一定的功能,為提高生殖細胞分化效率提供了線索。
【關(guān)鍵詞】：基因 BDULE基因 原始生殖細胞體外分化
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R711.6
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 綜述9-24
• 1. 原始生殖細胞9-19
• 1.1 原始生殖細胞的簡介9-10
• 1.2 原始生殖細胞的命運進程10-12
• 1.3 原始生殖細胞的發(fā)育潛能12-14
• 1.4 原始生殖細胞命運調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子14-16
• 1.5 原始生殖細胞特異的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)16-17
• 1.6 原始生殖細胞的表觀重編程17-19
• 1.7 總結(jié)19
• 2 DAZL和BOULE基因在生殖系統(tǒng)的關(guān)鍵作用19-24
• 2.1 關(guān)于DAZ家族基因的基礎(chǔ)知識19-20
• 2.2 DAZL和BOULE基因在小鼠生殖系統(tǒng)中的研究進展20-23
• 2.3 總結(jié)23-24
• 前言24-26
• 3 實驗材料26-31
• 3.1 實驗動物26
• 3.2 主要儀器設(shè)備26
• 3.3 實驗試劑與耗材26-28
• 3.4 實驗主要試劑與配制28-31
• 4 實驗步驟與方法31-43
• 4.1 小鼠飼養(yǎng)層細胞的建立與培養(yǎng)31-32
• 4.1.1 CF1小鼠胎兒成纖維細胞的分離與培養(yǎng)31
• 4.1.2 CF1小鼠成纖維細胞制作飼養(yǎng)層細胞31-32
• 4.2 Blimp1-mVenus和Stella-ECFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細胞系的建立32-33
• 4.2.1 BVSC囊胚的獲得32
• 4.2.2 胚胎干細胞系的建立32
• 4.2.3 BVSC胚胎干細胞系的建立32-33
• 4.3 質(zhì)粒抽提33-34
• 4.3.1 菌液的獲取33-34
• 4.3.2 質(zhì)粒大提34
• 4.4 慢病毒的包裝34
• 4.4.1 293T細胞擴增34
• 4.4.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染34
• 4.5 Blimp1、Prdm14、AP2γ過表達細胞系的建立34-37
• 4.5.1 小鼠胚胎干細胞系的復蘇、擴增35
• 4.5.2 病毒感染35
• 4.5.3 挑取亞克隆篩選建系35-37
• 4.6 過表達DAZL和BOULE小鼠ES細胞系的建立37-38
• 4.7 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄38-39
• 4.7.1 總RNA的提取38
• 4.7.2 反轉(zhuǎn)錄成cDNA38-39
• 4.8 Real-time PCR39-40
• 4.9 體外生殖分化40-41
• 4.9.1 胚胎干細胞向外胚層樣細胞的分化40-41
• 4.9.2 EpiLCs向PGCLCs的分化41
• 4.10 小鼠胚胎干細胞多能性蛋白免疫熒光染色41-42
• 4.11 基因組的提取42-43
• 實驗結(jié)果與分析43-50
• 1 Blimp1-mVenus和Stella-ECFP雙報告基因的小鼠胚胎干細胞系的建立43
• 2 穩(wěn)定整合Blimp1、Prdml4和AP2γ的小鼠胚胎干細胞系的建立43-45
• 3 DAZL和BOULE轉(zhuǎn)基因的細胞系的建立45-46
• 4 DAZL和BOULE加速PGCLCs的分化進程,提高PGCLCs的分化效率46-50
• 討論50-51
• 參考文獻51-61
• 致謝61

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