本文關(guān)鍵詞：miR-21在電離輻射誘導(dǎo)宮頸癌細胞自噬中作用的研究

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【摘要】：自噬是細胞處于應(yīng)激或損傷條件下，通過對細胞內(nèi)長壽命蛋白或廢用細胞器的降解，將降解產(chǎn)物包裹形成自噬體并由溶酶體降解，以維持細胞新陳代謝和實現(xiàn)物質(zhì)再利用的過程。自噬對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，表現(xiàn)在截然不同的兩個方面。一方面，自噬作為Ⅱ型程序性死亡方式，發(fā)揮抗腫瘤作用；另一方面，自噬作為一種適應(yīng)性反應(yīng)，可以保護腫瘤細胞對抗不利環(huán)境。 microRNA是一類小片段、進化保守的非編碼單鏈RNA，通過與靶基因3’UTR的結(jié)合，引起mRNA降解或轉(zhuǎn)錄抑制，從而抑制靶蛋白的合成，調(diào)控靶基因的功能，進而調(diào)控細胞的增殖、凋亡、自噬等。近年來，多項研究證實miR-21具有癌基因的作用，在乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌和結(jié)腸癌中均有高表達。輻射治療是宮頸癌常規(guī)的治療手段之一，約80％的宮頸癌患者接受單獨的放療或聯(lián)合放療的綜合療法。雖然miR-21在宮頸癌細胞的高表達也已被證實，但研究還不廣泛，miR-21與細胞自噬的關(guān)系及miR-21對電離輻射誘導(dǎo)細胞自噬的作用機制研究還未見報道。 目的 以人宮頸癌細胞株HeLa和SiHa為研究對象，闡述miR-21在電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細胞自噬中的作用及其機制，并探討miR-21在宮頸癌治療過程中的作用。 方法 ①細胞株：選用人宮頸癌細胞株HeLa和SiHa為研究對象；②照射條件：應(yīng)用深部X射線治療機進行細胞照射，電壓180kV，電流18.0mA，濾板為0.25mmCu和1.0mm Al，源靶距60cm，劑量率0.344Gy· min 1；③m iRNA的表達采用Real-Time PCR方法檢測；④蛋白表達變化采用Western blot檢測；⑤細胞存活檢測采用MTT法檢測；⑥細胞凋亡和細胞自噬采用流式細胞術(shù)檢測；⑦磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建HeLa-Beclin1Ri細胞模型；⑧采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用Student’s t-test或卡方檢驗分析數(shù)據(jù)，P 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；⑨Quantity One軟件對蛋白電泳條帶進行灰度分析。 結(jié)果 1.電離輻射誘導(dǎo)細胞自噬并促進miR-21的表達 HeLa和SiHa細胞經(jīng)過4Gy照射后，，蛋白電泳檢測MAPLC3的表達，發(fā)現(xiàn)在照射后16h、24h和32h這3個時間點LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均高于對照組。經(jīng)qRT-PCR檢測，HeLa細胞經(jīng)照射后miR-21的表達高于假照組1.7倍，SiHa細胞經(jīng)照射后miR-21的表達略有升高，為假照組的1.15倍。 2.miR-21調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因Beclin1的表達 在HeLa細胞中，給予4Gy電離輻射處理后，Beclin1表達高于假射組，mimic組的Beclin1蛋白的表達高于NC組，并且mimic+4Gy組Beclin1蛋白的表達高于NC+4Gy組。而在SiHa細胞中，Western blot結(jié)果顯示，IR組Beclin1的表達高于假照組。轉(zhuǎn)染mimic組的Beclin1蛋白表達低于NC組，并且mimic+4Gy組Beclin1蛋白的表達水平低于NC+4Gy組。 3. miR-21在電離輻射誘導(dǎo)HeLa細胞死亡中的作用 ①對細胞存活的影響：HeLa細胞分別轉(zhuǎn)染miR-21NC、mimic、inhibitor NC和inhibitor，轉(zhuǎn)染后24h給予不同劑量的電離輻射治療（0、4Gy、8Gy）。MTT結(jié)果顯示，在HeLa細胞中，各個劑量的電離輻射對NC組和mimic組/inhibitor NC組和inhibitor組細胞存活率沒有產(chǎn)生明顯的影響。②對凋亡的影響：轉(zhuǎn)染mimic后，與NC組相比，細胞凋亡率雖有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與NC+4Gy組比較，mimic+4Gy組細胞凋亡率明顯升高（P0.05）。inhibitor組細胞凋亡率較inhibitor NC組有所下降，聯(lián)合照射后，凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。③對自噬的影響：轉(zhuǎn)染mimic后，與NC組比較，細胞自噬顯著增加（P0.05）；聯(lián)合照射后，mimic+4Gy組自噬率明顯高于NC+4Gy組（P0.05）。以上結(jié)果說明過表達miR-21可以增加電離輻射誘導(dǎo)的HeLa細胞凋亡和自噬，但對細胞存活無明顯作用。 4. miR-21在電離輻射誘導(dǎo)SiHa細胞死亡中的作用 ①對細胞存活的影響：mimic+8Gy組細胞存活率較NC+8Gy組明顯升高，表明過表達miR-21可以抑制電離輻射誘導(dǎo)的細胞死亡。②對凋亡的影響：與NC+4Gy組比較，mimic+4Gy組凋亡率明顯降低（P0.05）。③對自噬的影響：mimic+4Gy組自噬率低于NC+4Gy組，inhibitor+4Gy組自噬率高于inhibitorNC+4Gy組（P0.05）。提示，在SiHa細胞中過表達miR-21可以抑制電離輻射誘導(dǎo)的自噬，抑制miR-21可以增加電離輻射誘導(dǎo)的自噬。 結(jié)論 1. miR-21在宮頸癌HeLa和SiHa細胞中對自噬發(fā)揮著不同的調(diào)控作用，在HeLa細胞中miR-21促進電離輻射誘導(dǎo)的自噬，在SiHa細胞中抑制電離輻射誘導(dǎo)的自噬。 2.在HeLa細胞中miR-21上調(diào)自噬相關(guān)基因Beclin1的表達，而在SiHa細胞中miR-21下調(diào)Beclin1的表達。 3.在SiHa細胞中，過表達miR-21可以抑制電離輻射誘導(dǎo)的細胞死亡。
【關(guān)鍵詞】：miR-21 自噬 宮頸癌 電離輻射 Beclin1
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文縮寫表13-15
• 第1章 緒論15-27
• 1.1 microRNA15-19
• 1.1.1 miRNA 的生物起源15-16
• 1.1.2 miRNA 的調(diào)控機制16-17
• 1.1.3 miRNA 靶基因的預(yù)測方法17
• 1.1.4 miRNA 與腫瘤17-19
• 1.1.5 miR-2119
• 1.2 自噬19-24
• 1.2.1 自噬的過程20-21
• 1.2.2 自噬相關(guān)通路及基因21-23
• 1.2.3 自噬與腫瘤23-24
• 1.2.4 電離輻射與自噬24
• 1.3 miRNA 與自噬24-25
• 1.4 立題依據(jù)25-27
• 第2章 材料與方法27-38
• 2.1 主要試劑及器材27-28
• 2.1.1 試劑27-28
• 2.1.2 器材28
• 2.2 主要儀器28-29
• 2.3 主要實驗材料和方法29-38
• 2.3.1 細胞株29-30
• 2.3.2 照射條件與方式30
• 2.3.3 細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 miRNA mimic/inhibitor30-31
• 2.3.4 RNA 提取與定量31
• 2.3.5 Quantitative real-time (qRT-PCR)31-32
• 2.3.6 蛋白質(zhì)免疫印記法(Western Blot)32-36
• 2.3.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡36
• 2.3.8 MDC 染色熒光顯微鏡觀察36
• 2.3.9 MDC 染色流式細胞術(shù)分析36
• 2.3.10 MTT 比色法檢測細胞增殖活性36-37
• 2.3.11 細胞模型的構(gòu)建37
• 2.3.12 統(tǒng)計學(xué)方法37-38
• 第3章 實驗結(jié)果38-52
• 3.1 電離輻射誘導(dǎo) HeLa 細胞自噬并促進 miR-21 的表達38-39
• 3.1.1 電離輻射誘導(dǎo) HeLa 細胞自噬38
• 3.1.2 電離輻射促進 miR-21 的表達38-39
• 3.2 miR-21 在電離輻射誘導(dǎo) HeLa 細胞死亡中的作用39-43
• 3.2.1 qRT-PCR 檢測 HeLa 細胞中 miR-21 轉(zhuǎn)染情況39-40
• 3.2.2 MTT 比色法檢測 miR-21 對電離輻射誘導(dǎo)的細胞存活的影響40
• 3.2.3 miR-21 對電離輻射誘導(dǎo)細胞凋亡的影響40-41
• 3.2.4 miR-21 對電離輻射誘導(dǎo)細胞自噬的影響41-43
• 3.3 miR-21 調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因 Beclin1 的表達43-45
• 3.3.1 Western blot 方法驗證 miR-21 上調(diào) Beclin1 的表達43-44
• 3.3.2 通過沉默模型驗證 miR-21 上調(diào) Beclin1 的表達44-45
• 3.4 電離輻射誘導(dǎo) SiHa 細胞自噬并促進 miR-21 的表達45-46
• 3.4.1 電離輻射誘導(dǎo) SiHa 細胞自噬45-46
• 3.4.2 SiHa 細胞中 miR-21 的表達46
• 3.5 miR-21 在電離輻射誘導(dǎo) SiHa 細胞死亡中的作用46-51
• 3.5.1 qRT-PCR 檢測 SiHa 細胞中 miR-21 轉(zhuǎn)染情況46-47
• 3.5.2 MTT 法檢測細胞存活47-48
• 3.5.3 miR-21 在電離輻射誘導(dǎo) SiHa 細胞凋亡中的作用48-49
• 3.5.4 miR-21 在電離輻射誘導(dǎo) SiHa 細胞自噬中的作用49-51
• 3.6 在 SiHa 細胞中 miR-21 下調(diào) Beclin1 的表達51-52
• 3.6.1 Western blot 方法驗證 miR-21 下調(diào) Beclin1 的表達51-52
• 第4章 討論52-56
• 第5章 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-66
• 作者簡介66-67
• 致謝67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 齊亞莉;張震宇;王洪艷;李金華;龔守良;;電離輻射誘導(dǎo)人乳腺癌細胞自噬與凋亡的關(guān)系[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年06期

本文編號：574598