本文關(guān)鍵詞：康普瑞汀磷酸鈉對(duì)孕鼠胚胎毒性和致畸性的初步研究

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【摘要】：癌癥是威脅人類健康、造成死亡的主要疾病之一。目前臨床上可通過(guò)手術(shù)切除腫瘤病灶、化療、放療等來(lái)治療癌癥,其中給予患者抗腫瘤藥物的化療方式是比較重要的治療方法。妊娠同時(shí)并發(fā)惡性腫瘤的幾率并不高,但隨著腫瘤發(fā)病年輕化、低齡化趨勢(shì)的出現(xiàn),臨床上妊娠合并惡性腫瘤的患者也在逐年增多。對(duì)于不適合手術(shù)的惡性腫瘤合并妊娠患者,當(dāng)其不愿意終止妊娠、但腫瘤病情又不能推遲到分娩后再行治療時(shí),選擇安全的化療藥物是可行的治療方法。但目前臨床上應(yīng)用的化療藥物中大部分是傳統(tǒng)的具有細(xì)胞毒性的藥物,機(jī)體易產(chǎn)生耐藥性,殺傷細(xì)胞時(shí)特異性不強(qiáng),在破壞腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)影響正常細(xì)胞的功能,顯然這類傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物不適用于妊娠合并惡性腫瘤的患者,因此研發(fā)新型細(xì)胞毒性藥物是目前各國(guó)研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。新型靶向細(xì)胞毒性藥物多具有從天然化產(chǎn)物(如植物、海洋生物等)中尋找的化學(xué)結(jié)構(gòu)和活性成分,能區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的差異,從而達(dá)到治療時(shí)高選擇性、低毒性的效果�？灯杖鹜×姿徕c(Combretastatin A-4 disodium phosphate,CA4P)是Combretastatin A-4(CA-4)的磷酸鈉鹽形式,是一種尚未上市的新型細(xì)胞毒性藥物,主要與細(xì)胞內(nèi)的秋水仙堿位點(diǎn)結(jié)合來(lái)抑制細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的聚合及細(xì)胞有絲分裂,使細(xì)胞停止增殖而殺傷腫瘤細(xì)胞,該藥物是微管蛋白抑制劑類抗腫瘤藥物的典型代表。傳統(tǒng)的微管蛋白類抑制劑需達(dá)到病人對(duì)該腫瘤藥物的最大耐受劑量附近時(shí)才能更好的發(fā)揮抗腫瘤作用,而CA-4只需最大耐受劑量的十分之一即可發(fā)揮其強(qiáng)大的抗腫瘤作用。它對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,包括部分多重耐藥腫瘤細(xì)胞。但是由于CA-4的水溶性很差,經(jīng)血管給藥困難,故將其制成了磷酸鈉鹽形式(CA-4P),這極大地改善了CA-4的水溶性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。由于磷酸脂酶在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的濃度高于正常細(xì)胞,CA-4P進(jìn)入體內(nèi)后使在腫瘤血管中被該酶選擇性激活,可靶向釋放出CA-4從而發(fā)揮抗血管、抗腫瘤的作用,是比較有前景的血管靶向劑。但是這個(gè)新型靶向藥物能否用于妊娠合并腫瘤患者的治療以及對(duì)妊娠母體和發(fā)育中的胎兒是否有毒性作用,尤其是致畸性如何尚未見(jiàn)明確報(bào)道。出生缺陷和先天畸形是常見(jiàn)并且后果嚴(yán)重的異常妊娠的結(jié)局,在給患兒本身及其家庭帶來(lái)身心痛苦和經(jīng)濟(jì)壓力的同時(shí),也會(huì)增加社會(huì)負(fù)擔(dān),而妊娠期間的不合理用藥是導(dǎo)致出生缺陷和先天畸形的主要因素之一。本研究選用妊娠SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,在其致畸敏感期給藥,初步探討該藥對(duì)孕鼠有無(wú)胚胎毒性及致畸毒性,并探索其安全治療給藥窗,為臨床上該藥對(duì)妊娠合并惡性腫瘤患者的治療及合理用藥提供參考依據(jù)。第一部分康普瑞汀磷酸鈉對(duì)孕鼠的胚胎毒性及致畸性研究目的:觀察康普瑞汀磷酸鈉(Combretastatin A-4 disodium phosphate,CA4P)對(duì)SD孕鼠的胚胎毒性及致畸作用。方法:實(shí)驗(yàn)時(shí)將性成熟SD雄鼠及雌鼠按1:1合籠交配,次日晨8點(diǎn)檢查雌鼠陰道有無(wú)乳白色陰栓來(lái)判斷交配是否成功,以查見(jiàn)陰栓當(dāng)日記為受孕的第0日(GD0)。將交配成功的雌鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組及溶媒對(duì)照組,每組20只。于妊娠第6~15日經(jīng)尾靜脈注射分別給予CA4P 0.15mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg(分別是臨床等效劑量的1倍、3倍,10倍),溶媒對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水,給藥容積均為10ml/kg,每日1次。給藥期間觀察孕鼠一般情況,并在妊娠第0、6、15、20日稱量孕鼠體重;妊娠第20日處死孕鼠,檢查孕鼠妊娠及胎鼠畸形情況,并逐個(gè)稱量子宮連胎重量、子宮重量、胎盤重量及活胎重量,統(tǒng)計(jì)卵巢黃體、吸收胎、死胎及活胎數(shù)目,計(jì)算胚胎著床率、活胎率、吸收胎率、死胎率;逐個(gè)測(cè)量活胎頂臀長(zhǎng)度,鑒定胎鼠性別。大致觀察胎鼠外觀畸形情況后將每窩胎鼠的一半放于Bouin氏液中,固定2周后取出,采用Wilsons切片法對(duì)胎鼠的頭部進(jìn)行檢查,觀察口、眼、鼻、腦室等有無(wú)發(fā)育畸形;剪開(kāi)胎鼠的胸腹腔,逐步檢查心、肝、脾、肺、腎的位置、數(shù)目、大小及形狀等;將每窩胎仔的另一半用95%乙醇溶液浸泡固定2周后,用茜紅素應(yīng)用液染色,再經(jīng)三種不同濃度甘油溶液透明后在解剖顯微鏡下檢查骨骼畸形情況。結(jié)果:與溶媒對(duì)照組相比,0.15mg/kg劑量組孕鼠及胎鼠未見(jiàn)明顯毒性表現(xiàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);0.50mg/kg劑量對(duì)孕鼠未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng),但對(duì)活胎體重、胎盤重量、活胎頂臀長(zhǎng)以及尾椎骨書、掌骨數(shù)、枕骨數(shù)、胸骨數(shù)有明顯影響,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);1.50mg/kg劑量對(duì)孕鼠體重增長(zhǎng)、胚胎著床率、吸收胎率、活胎率、活胎體重、活胎頂臀長(zhǎng)、胎盤重量以及尾椎數(shù)、掌骨數(shù)、枕骨數(shù)、胸骨數(shù)均有影響,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各劑量組胎鼠未見(jiàn)明顯的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等重要臟器畸形及外觀畸形。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)條件下,CA4P對(duì)親代孕鼠以及胚胎、胎仔發(fā)育未觀察到不良反應(yīng)的劑量水平分別為0.50mg/kg和0.15mg/kg,對(duì)胎仔未觀察到致畸作用的劑量水平是1.50mg/kg。第二部分康普瑞汀磷酸鈉胚胎毒性的機(jī)制初探目的:初步探討康普瑞汀磷酸鈉(CA4P)是否影響了母胎界面Th1、Th2細(xì)胞因子平衡從而導(dǎo)致孕鼠吸收胎增多。方法:將交配成功的雌鼠隨機(jī)分為低、高劑量實(shí)驗(yàn)組及溶媒對(duì)照組,每組12只,于妊娠第6~14日經(jīng)尾靜脈注射分別給予CA4P 1mg/kg、3mg/kg體重,溶媒對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水,給藥容積為10ml/kg,每日1次。妊娠第14日處死低、高劑量組及溶媒對(duì)照組孕鼠各6只,余下每組孕鼠于妊娠第20日處死;鈍性剝離孕鼠胎盤及子宮蛻膜組織,經(jīng)酶消化、洗滌、離心后取原代細(xì)胞;調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/ml接種在24孔板中,并放置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞共培養(yǎng);24小時(shí)后收集細(xì)胞上清,用Elisa酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-10、IL-4的量,并計(jì)算不同劑量組、不同孕期母胎界面細(xì)胞上清中Th1/Th2(IFN-γ/IL-10)細(xì)胞因子比值。結(jié)果:與溶媒對(duì)照組相比,1mg/kg的給藥劑量對(duì)孕鼠整個(gè)孕期的母胎界面IFN-γ、IL-10的分泌量無(wú)明顯影響,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Th1/Th2平衡無(wú)明顯偏移趨勢(shì)(P0.05);當(dāng)給藥劑量為3mg/kg時(shí),孕鼠不同孕期母胎界面的IFN-γ表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異;但I(xiàn)L-10的分泌量隨給藥劑量的增高而明顯降低,與對(duì)照組比較差異明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001);妊娠第14日時(shí),高劑量組Th1/Th2平衡明顯Th1方向偏移,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);妊娠第20日時(shí),高劑量組母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子平衡明顯向Th1方向漂移,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)條件下,CA4P不影響母胎界面IFN-γ的分泌量;高劑量時(shí)可使母胎界面IL-10分泌量降低,導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向Th1方向移動(dòng),而影響妊娠的維持。全文總結(jié):1、本實(shí)驗(yàn)條件下,CA4P對(duì)親代孕鼠以及胚胎、胎仔發(fā)育未觀察到不良反應(yīng)的劑量水平分別為0.50mg/kg和0.15mg/kg,對(duì)胎仔未觀察到致畸作用的劑量水平是1.50mg/kg。該藥在用于妊娠合并惡性腫瘤患者時(shí),若超過(guò)安全劑量則有導(dǎo)致胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩、甚至胎死宮內(nèi)可能,可能有潛在的致畸性。2、CA4P引起妊娠胚胎丟失的原因很多,但從免疫學(xué)角度看,該藥在體內(nèi)超過(guò)一定劑量時(shí)可導(dǎo)致母胎界面Th1/Th2平衡向Th1方向漂移,從而導(dǎo)致妊娠的終止,吸收胎增多。由于目前對(duì)CA4P的相關(guān)研究較少,至于它是直接通過(guò)細(xì)胞毒作用損傷了母胎界面分泌Th1、Th2型的免疫細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞,導(dǎo)致了平衡偏移,還是像傳統(tǒng)化療藥物一樣影響了機(jī)體全身免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致母胎界面Th1/Th2平衡被動(dòng)的偏移機(jī)制尚不清楚,仍待進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：CA4P 大鼠 胚胎毒性 致畸性 吸收胎 Th1、Th2細(xì)胞因子 IFN-γ IL-10
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R714.2
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 英文縮略詞表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 康普瑞汀磷酸鈉對(duì)孕鼠的胚胎毒性及致畸性研究17-31
• 一、材料與方法17-21
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-27
• 三、討論27-30
• 四、小結(jié)30-31
• 第二部分 康普瑞汀磷酸鈉胚胎毒性機(jī)制的初步探討31-40
• 一、材料與方法32-35
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-37
• 三、討論37-39
• 四、小結(jié)39-40
• 全文總結(jié)40-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 綜述 妊娠合并婦科惡性腫瘤的治療進(jìn)展46-58
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明58-59
• 致謝59

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