發(fā)布時間：2017-07-06 22:05

  本文關(guān)鍵詞：NOS1調(diào)控ABCG2的表達促進卵巢癌細胞順鉑耐藥的研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌(ovarian cancer. OC)是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率高居婦科惡性腫瘤之首,晚期卵巢癌患者5年生存率僅約30%。盡管目前手術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療的治療方案已日臻成熟,但卵巢癌患者的生存率仍然比較低,其中一個重要的原因是大部分患者最終會出現(xiàn)化療耐藥而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。因此,深入認識卵巢癌的耐藥機制,有效改善不良預(yù)后是卵巢癌臨床治療和基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵問題。研究表明,一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)在多種腫瘤組織中普遍表達增強,可促進腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和化療藥物抵抗。人體有三種NOS(NOS1, NOS2和NOS3)。它們均通過氧化L-精氨酸合成一氧化氮(Nitric oxide, NO). NOS1和NOS3分泌較低濃度的NO,促進腫瘤生長和血管生成。而NOS2主要存在于肥大細胞、巨噬細胞及中性粒細胞,受到外界刺激后被激活,可產(chǎn)生高濃度的NO,誘導(dǎo)炎癥相關(guān)反應(yīng),促進或影響腫瘤生長。低濃度NO促進腫瘤生長,而高濃度NO則抑制腫瘤生長。抑制腫瘤生長的濃度要比促進腫瘤生長時濃度高10-100倍。目前已有研究證實,不同的NOS亞型與結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤等惡性腫瘤的化療耐藥表型有關(guān)。此外,NOS1產(chǎn)生的較低濃度的NO對腫瘤細胞具有保護性作用,抑制腫瘤細胞的凋亡,從而導(dǎo)致腫瘤耐受化療藥物,導(dǎo)致耐藥乃至腫瘤復(fù)發(fā)。然而,目前關(guān)于NOS 1對卵巢癌化療敏感性的影響及其調(diào)控機制尚未完全闡明。高表達ATP結(jié)合盒G超家族成員2(ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2)是介導(dǎo)多種惡性腫瘤細胞多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)的主要機制。ABCG2作為一種多次跨膜蛋白,可以利用ATP水解提供的能量主動的將腫瘤細胞中的化療藥物等外來物質(zhì)泵出細胞外,導(dǎo)致惡性腫瘤細胞逃避化療藥物殺傷作用,是化療失敗的重要因素之一。ABCG2在多種腫瘤細胞中都報道其表達增強,包括食管癌、子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌以及黑色素瘤等。卵巢癌細胞系中ABCG2+細胞對化療藥物長春新堿的耐受性高于ABCG2-細胞,而ABCG2抗體可增加ABCG2+細胞對長春新堿的敏感性。ABCG2與肺癌、食管癌、急性白血病等多種惡性腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。近年來有研究表明,ABCG2作為還原性物質(zhì)谷胱甘肽(glutathione, GSH)的轉(zhuǎn)運子,在細胞內(nèi)氧化還原平衡中起著重要作用。此外,ABCG2可以限制葉綠酸-A以及卟啉類化合物的攝入,從而影響細胞內(nèi)單態(tài)氧產(chǎn)生,導(dǎo)致DNA水解及細胞凋亡的發(fā)生。這些研究提示,ABCG2對惡性腫瘤化療敏感性的影響除了其自身藥物泵的生理功能起作用外,還有可能與細胞內(nèi)的氧化還原平衡有關(guān)。有研究證實,NOS通過其產(chǎn)物NO促進抗氧化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子HIF-la, Nrf2等的活性,上調(diào)抗氧化物質(zhì)SOD、TrxRl的轉(zhuǎn)錄,進而增強腫瘤細胞對化療后局部組織的缺氧環(huán)境的耐受能力,減少腫瘤細胞凋亡,促進耐藥的發(fā)生發(fā)展。然而,對于NOS/NO相關(guān)的化療耐藥是否與經(jīng)典的多藥耐藥基因ABCG2有關(guān),兩者之間潛在的機制如何,尚未見研究報道。我們通過實驗發(fā)現(xiàn),NOS1可以調(diào)控多藥耐藥基因ABCG2的表達,并且NOS1導(dǎo)致的卵巢癌化療耐藥部分依賴ABCG2的增強。我們進一步探索了NOS1調(diào)控ABCG2的可能機制,以期為逆轉(zhuǎn)卵巢癌的鉑類耐藥、改善卵巢癌患者的預(yù)后提供更新更好的策略。研究目的卵巢癌死亡率居婦科惡性腫瘤之首。化療耐藥是其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移乃至死亡的主要原因。本課題前期研究表明NOSs影響卵巢癌細胞的生物學(xué)功能,包括增殖、侵襲、遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)功能。另外,通過芯片數(shù)據(jù)分析NOS在卵巢癌中表達增強,與卵巢化療耐藥相關(guān)。在此基礎(chǔ)上,本課題從多藥耐藥相關(guān)基因ABCG2入手,探討NOS影響卵巢癌順鉑耐藥的可能機制。(一)NOS與卵巢癌ABCG2表達、化療敏感性及預(yù)后的相關(guān)性研究方法1)根據(jù)Pubmed公共資源GEO數(shù)據(jù)庫中卵巢癌組織的全基因表達譜數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析,討論三種NOS亞型(NOS1, NOS2, NOS3)與ABCG2表達的相關(guān)性；2)利用Kalan-Meier法分析三種NOS亞型表達水平與卵巢癌患者生存時間的相關(guān)性,從而明確NOSs是否可能參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程；3)利用鉑類敏感性卵巢癌組織和耐藥性卵巢癌組織表達譜芯片,分析三種NOS亞型以及ABCG2的表達水平與卵巢癌鉑類敏感性的相關(guān)性。研究結(jié)果1)NOS1與ABCG2的表達存在正相關(guān)關(guān)系,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.211,P0.01)；NOS2與ABCG2的表達存在負相關(guān)關(guān)系,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.422, P0.01); NOS3與ABCG2的表達存在正相關(guān)關(guān)系,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.342,P0.01)。提示NOS的三種亞型對多藥耐藥基因ABCG2的表達以及卵巢癌化療耐藥可能具有不同的作用；2)NOS1和ABCG2高表達的卵巢癌患者生存時間短、預(yù)后差, 其中NOS1和ABCG2相關(guān)顯著性分別為P=0.0421和P=0.0237 (Log-rank Test),但NOS2、NOS3與生存的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義；3)鉑類耐藥組卵巢癌組織中ABCG2的表達量顯著高于鉑類敏感組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.184, P0.05); NOS1在鉑類耐藥組中的表達量高于鉑類敏感組(t=1.189, P=0.245), NOS2在鉑類耐藥組中的表達量低于鉑類敏感組(t=-0.836,P=0.411), NOS3在兩組中的差異不明顯(t=0.15,P=0.882)。研究結(jié)論1)三種NOS亞型與ABCG2有不同的相關(guān)關(guān)系,其中NOS1及NOS3與ABCG2均呈正相關(guān)關(guān)系,而NOS2與ABCG2呈負相關(guān)關(guān)系；2)NOS1與卵巢癌患者的生存時間相關(guān),NOS2和NOS3與卵巢癌患者的生存時間無關(guān)；3) ABCG2與卵巢癌患者的生存時間相關(guān)；(二)NOS1對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響研究方法1)MTT實驗檢測卵巢癌細胞株OVCAR-3和SKOV-3對順鉑敏感性的差異；2)MTT實驗檢測NOS1過表達的GV375-NOS1 ov-3和對照組GV375-NCov-3細胞對順鉑的敏感性的差異；3)MTT實驗檢測干擾NOS1表達的SKOV-3細胞si-NOS1 SKOV-3以及對照細胞si-NC SKOV-3對順鉑敏感性的差異。4)預(yù)先使用順鉑聯(lián)合NOS各型抑制劑以及NO供體處理OVCAR-3細胞,運用流式細胞儀Annexin V法檢測細胞凋亡及細胞死亡。5) Western blot實驗檢測順鉑聯(lián)合NOS抑制劑處理對于卵巢癌細胞株中ABCG2表達的影響。研究結(jié)果1)順鉑作用48小時后的人卵巢上皮性癌細胞株SKOV-3和OVCAR-3,半數(shù)抑制率(half maximal inhibitory concentration. IC50)之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.358,P0.05)；2)順鉑作用48小時后的人卵巢上皮性癌細胞株GV375-NOS1 ov-3和GV375-NC ov-3細胞,IC50之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-25.739,P0.01)；3)順鉑作用48小時后的人卵巢上皮性癌細胞株si-NOS1 SKOV-3和si-NC SKOV-3細胞,IC50之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.128,P0.05)；4)順鉑可以提高卵巢癌細胞中ABCG2的表達量,NOS抑制劑可逆轉(zhuǎn)ABCG2的表達增強；5)順鉑單獨作用72小時或順鉑作用72小時聯(lián)合NOS抑制劑或NO供體作用48小時后的OVCAR-3細胞之間的細胞凋亡率具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.637,P0.01)；6)順鉑單獨作用72小時或順鉑作用72小時聯(lián)合NOS抑制劑或NO供體作用48小時后的OVCAR-3細胞之間的細胞凋亡率具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.098,P0.01)。研究結(jié)論1)NOS1過表達增強了OVCAR-3對順鉑的耐藥性；2)干擾NOS1的表達增強了SKOV-3對順鉑的敏感性；3) NOS1特異性抑制劑N-PLA聯(lián)用順鉑相比于順鉑單藥處理,增加了卵巢癌細胞的細胞凋亡及非凋亡性死亡率,N-PLA促進了順鉑對卵巢癌細胞的殺傷作用,從而提示抑制NOS1功能增加了卵巢癌的順鉑敏感性；4) 順鉑可以提高卵巢癌細胞中ABCG2的表達量,NOS泛抑制劑和NOS1抑制劑可逆轉(zhuǎn)ABCG2的表達增強,提示NOS1可能通過調(diào)節(jié)ABCG2的表達調(diào)控卵巢癌細胞的順鉑敏感性。(三)NOS1通過上調(diào)ABCG2增強卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性研究方法1) qRT-PCR和Western Blot方法檢測NOS泛抑制劑L-NAME對卵巢癌細胞中ABCG2基因表達的影響；2) Western Blot方法檢測NOS幾種不同的抑制劑對卵巢癌細胞中ABCG2基因表達的影響；3) Western Blot方法檢測過表達NOS1的卵巢癌細胞及其對照細胞中ABCG2表達情況；4)免疫組化檢測NOS1過表達對卵巢癌細胞裸鼠皮下移植瘤組織中ABCG2表達的影響。5)MTT實驗檢測ABCG2功能抑制劑維拉帕米對過表達NOS1的卵巢癌細胞株的順鉑敏感性的影響。研究結(jié)果1) L-NAME處理后48 h的OVCAR-3細胞和對照組細胞相比,ABCG2的mRNA表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),ABCG2的蛋白表達水平明顯降低；2)NOS2特異性抑制劑1400W處理后OVCAR-3細胞和對照組細胞相比,ABCG2的蛋白表達降低；NOS1特異性抑制劑N-PLA處理后ABCG2蛋白表達量明顯降低;3)NOS1過表達的GV375-NOS1 ov-3和對照組GV375-NC ov-3細胞相比,NOS1的蛋白表達量明顯高于對照組細胞,ABCG2基因的蛋白表達量明顯高于對照組細胞；4)NOS1過表達的裸鼠皮下移植瘤和對照組裸鼠皮下移植瘤組織細胞中的ABCG2陽性率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-15.697；P0.01)。5)NOS1過表達增強卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性,抑制ABCG2的功能可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。研究結(jié)論本章從基因水平驗證NOS1可調(diào)控ABCG2的表達水平,卵巢癌細胞由于NOS1過表達而增加的順鉑耐藥性,可以被ABCG2的功能抑制劑逆轉(zhuǎn)。說明NOS1通過調(diào)節(jié)ABCG2調(diào)控卵巢癌的順鉑敏感性。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 NOS 耐藥 ABCG2
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-18
• 前言18-23
• 參考文獻20-23
• 第一章 NOS與卵巢癌ABCG2表達、化療敏感性及預(yù)后的相關(guān)性23-27
• 一、引言23
• 二、實驗材料與方法23-24
• 三、結(jié)果24-26
• 四、結(jié)論26-27
• 第二章 NOS1對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響27-51
• 一、引言27
• 二、實驗材料與方法27-38
• 三、結(jié)果38-50
• 四、結(jié)論50-51
• 第三章 NOS1通過上調(diào)ABCG2增強卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性51-70
• 一、引言51
• 二、實驗材料與方法51-64
• 三、結(jié)果64-69
• 四、結(jié)論69-70
• 討論70-72
• 參考文獻72-74
• 綜述74-78
• S每嘉南，
  
  本文編號：527931
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