本文關鍵詞：人類早期胚胎植入前高通量測序遺傳學篩查的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本研究利用單細胞全基因組擴增(WGA)和高通量測序技術對人類早期胚胎植入前的遺傳學信息進行篩查,從而為高通量測序技術在提高PGS/PGD技術的安全有效性方面奠定方法學基礎。方法:選取于我院生殖中心行IVF/ICSI-ET并已生育健康嬰兒的患者,他們將凍存的剩余第三天優(yōu)質(zhì)胚胎41枚和囊胚9枚自愿捐獻用于科研并簽署知情同意書。D3胚胎和囊胚分別活檢單個卵裂球細胞和滋養(yǎng)外胚層5~10個細胞進行全基因組擴增(單細胞裂解、文庫制備、擴增、檢測擴增產(chǎn)物的濃度和完整性)�；顧z后D3胚胎進一步培養(yǎng)觀察,若有囊胚形成則再行囊胚活檢和全基因組擴增。全基因組擴增后進行高通量測序,將待測片段與微球體連接和cDNA序列測定從而對植入前胚胎進行染色體數(shù)目和16Mb以上缺失、重復的篩查。結果:1、活檢胚胎來源:41枚D3胚胎和9枚囊胚經(jīng)解凍復蘇后均存活。D3胚胎活檢后發(fā)育成囊胚的共5枚,共對55枚(D3胚胎41枚和囊胚14枚)胚胎進行活檢和全基因組擴增。2、全基因組擴增結果:42枚胚胎擴增成功(D3胚胎28枚和囊胚14枚),總擴增成功率為76.4%(42/55)。D3胚胎中28枚擴增成功,13枚擴增失敗,D3胚胎單細胞的擴增成功率68.3%(28/41)。14枚囊胚全部擴增成功。對這42枚胚胎的全基因組擴增產(chǎn)物進行高通量測序分析。3、D3胚胎的高通量測序分析結果:28枚D3胚胎中11枚未檢測出染色體數(shù)目異常和16Mb以上缺失和重復;2枚胚胎檢出染色體數(shù)目異常,5枚胚胎檢出片段16Mb的染色體缺失或重復,10枚胚胎檢出染色體數(shù)目異常合并片段16Mb的缺失或重復。4、囊胚的高通量測序分析結果:14枚囊胚中8枚未檢測出染色體數(shù)目異常和16Mb以上缺失和重復,5枚胚胎檢出染色體數(shù)目異常,1枚胚胎檢出片段16Mb的染色體缺失或重復。5、高通量測序技術染色體數(shù)目異常和16Mb的缺失、重復檢出率:本研究中總體染色體數(shù)目異�；蛘�16Mb染色體片段的缺失、重復的檢出率為54.8%(23/42),D3胚胎和囊胚的檢出率分別為60.7%(17/28)和42.9%(6/14)。6、同一胚胎的D3和囊胚期的高通量測序分析結果:5枚胚胎分別在D3和D5(囊胚)做了單細胞活檢和滋養(yǎng)層細胞活檢、全基因組擴增和高通量測序,結果顯示同一胚胎的D3單細胞和囊胚滋養(yǎng)外胚層的染色體檢出信息是基本一致的。7、對捐獻胚胎的患者夫婦(共8對)的臨床資料進行回顧性分析發(fā)現(xiàn):這些夫婦均單獨存在或合并存在女方高齡(大于等于35歲)、嚴重男方因素,反復植入失敗和不良妊娠史,所有檢測的胚胎均來自存在這些高危因素的夫婦。涉及女方高齡、嚴重男方因素,反復植入失敗和不良妊娠史因素的胚胎染色體數(shù)目異�；�16Mb的缺失或重復異常檢出率分別為80%,33.33%,33.33%和28.57%。結論:1、人類D3胚胎(7~9細胞)可以通過單卵裂球活檢、單細胞全基因組擴增和高通量測序進行PGS/PGD,解決了囊胚形成率低無可活檢的胚胎用于PGS/PGD這一問題,擴展了高通量測序的適用范圍,更有利于高通量測序技術的臨床推廣和應用。2、在體外受精—胚胎移植技術中,即使是優(yōu)質(zhì)胚胎,仍然存在一定比例的染色體數(shù)目異常或染色體的缺失重復,這可能是輔助生育技術中種植失敗或流產(chǎn)的重要原因。3、女方高齡、嚴重男方因素、反復植入失敗和具有不良妊娠史患者的胚胎具有較高的遺傳學異常的風險,PGS技術可能有助于提高上述患者助孕治療的成功率和抱嬰率。4、分子生物學的飛速發(fā)展為PGS/PGD提供了更多的手段,胚胎的基因學信息會更精細和廣泛,但是基因的片段與功能、表型、疾病之間的關系研究將是一個長期巨大的工作和課題。因此,PGS/PGD技術必須基于和患者的充分告知和知情同意,必須結合產(chǎn)前診斷和出生隨訪,才能保證這一技術安全有效的進行,提高助孕治療的成功率和活產(chǎn)率。
【關鍵詞】：植入前遺傳學篩查 高通量測序 單細胞全基因組擴增 染色體數(shù)目異常 缺失重復 體外受精 胚胎移植
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 1.研究對象15-17
• 2.研究方法17-21
• 2.1 單個卵裂球細胞的活檢17-18
• 2.2 囊胚期滋養(yǎng)外胚層細胞的活檢18-19
• 2.3 樣品包裝和運輸19
• 2.4 單細胞全基因組擴增（sigma試劑盒, DOP-PCR技術原理）19-20
• 2.4.1 單細胞裂解19
• 2.4.2 文庫制備19
• 2.4.3 擴增19-20
• 2.4.4 擴增產(chǎn)物濃度檢測20
• 2.4.5 擴增產(chǎn)物完整性檢測20
• 2.5.高通量測序（high-throughput sequencing）20-21
• 2.5.1 待測片段與微球體連接20
• 2.5.2 cDNA序列測定20
• 2.5.3 結果判讀20-21
• 3.結果21-31
• 3.1 一般資料21
• 3.2 檢測結果21-22
• 3.2.1 全基因組擴增結果21
• 3.2.2 高通量測序結果21-22
• 3.3.電泳膠圖22-27
• 3.4.核型分析圖27-30
• 3.5.胚胎的臨床資料回顧性分析30-31
• 4.討論31-46
• 4.1 染色體異常的發(fā)生機制和影響因素31-33
• 4.2 胚胎植入前遺傳學篩查（Preimplantation genetic screening）33-35
• 4.3 全基因組擴增（whole genome amplification,WGA）35-37
• 4.3.1 引物延伸預擴增（PEP）35
• 4.3.2 簡并寡核苷酸引物-PCR（DOP-PCR）技術35-36
• 4.3.3 多重置換擴增（MDA）技術36-37
• 4.3.4 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術（MALBAC）37
• 4.4 高通量測序技術（High-throughput sequencing）37-39
• 4.5.拷貝數(shù)變異（Copy-number variant，CNV）39-40
• 4.5.1CNV基本概述39
• 4.5.2 高通量測序技術應用于CNV分析39-40
• 4.6 各種檢測技術的比較40-41
• 4.6.1 聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction,PCR)40
• 4.6.2 熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization,FISH） 2940-41
• 4.6.3 比較基因組雜交技術（comparative genomic hybridization,CGH）和微陣列-比較基因組雜交技術（array-CGH）41
• 4.6.4 單核苷酸多態(tài)性-微陣列（SNP-array）41
• 4.6.5 高通量測序技術（High-throughput sequencing）41
• 4.7 存在的問題41-44
• 4.7.1 全基因組擴增中存在的問題41-43
• 4.7.2 高通量測序技術中存在的問題43
• 4.7.3 嵌合體43-44
• 4.8.高通量測序技術應用于D3胚胎單細胞PGS44-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-54
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明54-55
• 綜述55-64
• 綜述參考文獻61-64
• 致謝64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 史秋雯;丘映;許長龍;黃茜;陳萍;;用11色探針檢測植入前胚胎非整倍體的實驗研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2013年07期

  本文關鍵詞：人類早期胚胎植入前高通量測序遺傳學篩查的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：409319