本文關鍵詞：細胞自噬在宮頸癌細胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:宮頸癌是婦科腫瘤中常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于乳腺癌,是威脅女性生命健康的第二大惡性腫瘤。近年來的臨床數(shù)據(jù)顯示,宮頸癌的發(fā)病有年輕化發(fā)展的趨勢,且晚期宮頸癌治愈難、易復發(fā),然而目前的治療手段毒副作用大,因此亟需尋找有效的宮頸癌治療手段。在可用于宮頸癌治療的化療藥物中,鹽酸吡柔比星為第三代蒽環(huán)類抗腫瘤藥物。臨床試驗證明,鹽酸吡柔比星還可用于膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌等多種實體腫瘤的治療,治療過程中引起的免疫抑制、胃腸道刺激等毒副作用均較順鉑等化療藥物小,具有良好的臨床應用前景。但宮頸癌的臨床Ⅱ期實驗結果顯示,大部分宮頸癌患者對鹽酸吡柔比星的治療不敏感。因此,探討宮頸癌細胞抵抗鹽酸吡柔比星的相關機制,尋找相應增敏措施,將有助于宮頸癌的臨床治療。細胞自噬是真核細胞在遭受外界生存環(huán)境壓力時啟動的通過降解自身物質并利用降解產(chǎn)物而補充細胞存活需求的過程。越來越多的研究表明,無論是腫瘤細胞本身對化療的不敏感,還是后天化療過程中獲得的治療抵抗,細胞自噬均發(fā)揮了重要作用。研究表明,細胞自噬在膀胱癌、乳腺癌等對鹽酸吡柔比星及其同類藥物的治療抵抗中發(fā)揮重要作用,提示細胞自噬可能是宮頸癌細胞對鹽酸吡柔比星治療不敏感的重要機制。因此,本研究的目的在于探討細胞自噬在宮頸癌細胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及其分子機制,從而為設計針對性的增敏策略提供依據(jù)。研究內(nèi)容及研究方法:第一部分細胞自噬促進宮頸癌細胞對鹽酸吡柔比星治療抵抗1.驗證鹽酸吡柔比星對宮頸癌細胞存活及死亡的影響。2.確定鹽酸吡柔比星對自噬的誘導作用。3.通過聯(lián)合使用自噬抑制劑,確定細胞自噬在鹽酸吡柔比星殺傷宮頸癌細胞中的作用。第二部分miR34c-5p/ATG4B通路在宮頸癌細胞中介導了鹽酸吡柔比星誘導的保護性細胞自噬反應1.經(jīng)鹽酸吡柔比星處理后,分別在m RNA水平及蛋白水平篩選宮頸癌細胞中表達變化最明顯的自噬相關分子,并結合基因沉默技術評估其對鹽酸吡柔比星所誘導細胞自噬反應的影響,以確定該分子在這一過程中的作用。2.通過雙螢光素酶報告基因實驗確定鹽酸吡柔比星對ATG4B基因轉錄活性的影響;通過RNA半衰期實驗確定鹽酸吡柔比星對ATG4B m RNA穩(wěn)定性的影響。3.分析并篩選靶向ATG4B的micro RNAs,通過RNA半衰期實驗確定其在鹽酸吡柔比星穩(wěn)定ATG4B m RNA過程中發(fā)揮的作用,通過雙螢光素酶報告基因實驗證實該micro RNA與ATG4B m RNA間作用的方式及靶點。4.驗證miR34c-5p介導的ATG4B下調在鹽酸吡柔比星誘導的細胞自噬、細胞凋亡以及抑制細胞存活過程中的作用。5.移植瘤實驗體內(nèi)檢測鹽酸吡柔比星對miR34c-5p及ATG4B表達的影響。第三部分miR34/ATG4B信號通路在調節(jié)細胞自噬過程中的普遍意義1.驗證表柔比星及多柔比星是否誘導宮頸癌細胞的保護性細胞自噬反應,以及靶向抑制miR34c-5p或ATG4B能否增敏藥物的殺細胞效果。2.檢測雷帕霉素誘導的自噬反應中ATG4B、miR34的變化,以及靶向miR34、ATG4B對雷帕霉素誘導的自噬反應是否有影響。根據(jù)上述實驗內(nèi)容,主要用到的研究方法有:1.宮頸癌細胞系C33A、Si Ha、He La細胞及卵巢癌SKOV3的體外培養(yǎng)及傳代。2.CCK-8實驗檢測細胞的生長抑制情況。3.臺盼藍染色實驗檢測細胞的死亡率。4.流式細胞術、Hoechst 33342染色檢測細胞的凋亡情況。5.Real-time PCR及Western blot檢測細胞中m RNA、蛋白的表達變化。6.分子克隆技術構建質粒。7.瞬時轉染技術實現(xiàn)細胞內(nèi)分子表達量的改變。8.熒光顯微鏡下觀察自噬小點陽性細胞率的改變,確定自噬水平的變化。9.雙螢光素酶報告基因實驗檢測目的基因5'端或3'端活性的改變。10.RNA合成抑制實驗檢測目的基因m RNA穩(wěn)定性的改變。11.動物實驗證實鹽酸吡柔比星對在體宮頸癌的影響。結果:1.鹽酸吡柔比星在誘導宮頸癌細胞凋亡的同時還誘導了保護性細胞自噬反應,這是導致宮頸癌細胞對鹽酸吡柔比星不敏感的重要機制。2.在宮頸癌細胞中,自噬相關分子ATG4B介導了鹽酸吡柔比星誘導的保護性細胞自噬反應。3.在鹽酸吡柔比星誘導的保護性細胞自噬反應中,ATG4B上調是由于其自身m RNA穩(wěn)定性的增強,而不是轉錄活性的增加。4.miR34a及miR34c-5p均可靶向ATG4B m RNA的3′非翻譯區(qū)而調節(jié)ATG4B的表達水平,但在鹽酸吡柔比星處理的宮頸癌細胞中,僅miR34c-5p發(fā)揮作用。5.miR34c-5p/ATG4B信號通路在宮頸癌細胞中介導了鹽酸吡柔比星誘導的保護性細胞自噬反應。6.移植瘤小鼠實驗進一步證實鹽酸吡柔比星對在體宮頸癌細胞同樣可以誘導miR34c-5p/ATG4B/自噬信號機制的發(fā)生。7.miR34/ATG4B信號通路對于自噬水平的調節(jié)具有普遍意義。結論:在宮頸癌細胞中,鹽酸吡柔比星通過下調miR34c-5p,導致其對ATG4B m RNA的降解減少從而上調了ATG4B的表達,增強了自噬反應。增強的自噬反應對細胞起保護作用,從而導致了宮頸癌細胞對鹽酸吡柔比星治療的不敏感。靶向miR34c-5p或ATG4B均可增敏鹽酸吡柔比星對宮頸癌細胞的殺傷作用。miR34/ATG4B信號通路對于自噬水平的調節(jié)具有普遍意義。
【關鍵詞】：ATG4B 細胞自噬 宮頸癌 鹽酸吡柔比星 miR34c-5p
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 細胞自噬促進宮頸癌細胞對鹽酸吡柔比星治療抵抗13-26
• 2.1 材料與方法13-20
• 2.2 結果20-23
• 2.3 討論23-25
• 2.4 結論25-26
• 第三章 miR34c-5p/ATG4B通路在宮頸癌細胞中介導了鹽酸吡柔比星誘導的保護性細胞自噬反應26-51
• 3.1 材料與方法27-42
• 3.2 結果42-48
• 3.3 討論48-50
• 3.4 結論50-51
• 第四章 miR34/ATG4B信號通路在調節(jié)細胞自噬過程中的普遍意義51-60
• 4.1 材料與方法52-54
• 4.2 結果54-58
• 4.3 討論58-59
• 4.4 結論59-60
• 全文結論60-61
• 參考文獻61-66
• 文獻綜述 細胞自噬在腫瘤治療方面的研究進展66-74
• 參考文獻71-74
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況74-75
• 致謝75

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 楊蕾;黃紅兵;陳倩超;劉韜;王人英;;鹽酸吡柔比星在不同注射液中的穩(wěn)定性考察[J];今日藥學;2009年06期

2 張淑芳;胡喜鋼;曹漫明;汪森明;;葉酸-葡聚糖-鹽酸吡柔比星偶聯(lián)物對人胃癌SGC-7901細胞的靶向作用[J];山西醫(yī)藥雜志;2007年03期

3 張婧;賀江虹;董雅璐;王勇強;張積仁;;預設靶標免疫靶向鹽酸吡柔比星治療小鼠S180肉瘤的試驗研究[J];實用醫(yī)學雜志;2009年20期

4 ;[J];;年期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳亞冉;細胞自噬在宮頸癌細胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2016年

  本文關鍵詞：細胞自噬在宮頸癌細胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：358935