發(fā)布時(shí)間：2021-06-27 19:59

　　第一部分HPV16 E6、IL-28B基因在真核表達(dá)載體的構(gòu)建目的:應(yīng)用克隆技術(shù)將人乳頭瘤病毒16的E6、IL-28B基因序列構(gòu)建于真核表達(dá)載體畢赤酵母系統(tǒng)上,進(jìn)一步篩選和優(yōu)化,用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)其蛋白,為宮頸癌的免疫治療提供基礎(chǔ)。方法:在geneback庫(kù)中找到E6和IL-28B的cDNA序列,實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建在原核表達(dá)載體的E6及IL-28B與基因庫(kù)查找序列一致。購(gòu)買(mǎi)Ppic-9k-his質(zhì)粒,公司提供序列與基因庫(kù)中比對(duì)結(jié)果一致,選擇EcoRⅠ和NoTⅠ酶切位點(diǎn),用primer軟件設(shè)計(jì)引物,PCR等分子克隆技術(shù)將E6及IL-28B的cDNA序列構(gòu)建在真核表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K-his上,轉(zhuǎn)化GS115宿主菌,用G418抗生素篩選出高拷貝菌,優(yōu)化表達(dá)條件。結(jié)果:通過(guò)分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了畢赤酵母表達(dá)載體Ppic9k-his-E6、pPIC9K-his-IL-28B,通過(guò)G418篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子,通過(guò)優(yōu)化不同的誘導(dǎo)表達(dá)條件,摸索了外源基因IL-28B、E6在畢赤酵母受體細(xì)胞的表達(dá),其誘導(dǎo)條件需要進(jìn)一步的改進(jìn),為進(jìn)一步研究宮頸癌免疫治療和治療性疫苗做了準(zhǔn)備。結(jié)論:成功構(gòu)建了pPIC9K-h... 

【文章來(lái)源】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1分子克隆實(shí)驗(yàn)流程圖

37℃、30 min，在 65℃水浴鍋中滅活 10min。 重組質(zhì)粒 Ppic9k-his-E6、Ppic9k-his-IL-28B 的電轉(zhuǎn)化Ppic9k-his-E6、Ppic9k-his-IL-28B 重組質(zhì)粒在超凈臺(tái)中取出 5ul，置于提前GS115 感受態(tài)細(xì)胞中，將其放置在冰水混合物中。將預(yù)冷的 Ppic9k-his-E6、Ppic9k-his-IL-28B 重組質(zhì)粒和酵母感受態(tài)細(xì)胞混杯中，電轉(zhuǎn)儀操作流程及參數(shù)設(shè)置如圖 1-2 所示：試劑 E6 線性化體系 IL-28B 線性化體系ddH20 12 ul 12 ul10xH buffer 2 ul 2 ulsacⅠ - 2 ulsalⅠ 2 ul -重組質(zhì)粒 4 ul 4 ul

酵母載體結(jié)構(gòu)圖


本文編號(hào)：3253512