本文關鍵詞：siRNA靶向沉默COX-2對子宮內膜異位癥在位、異位子宮內膜間質細胞VEGF、MMP-9表達及細胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：子宮內膜異位癥(endometriosis,EMT)簡稱內異癥,近年來越來越引起婦產科臨床的關注,多見于育齡期婦女,被定義為具有生長功能的子宮內膜組織(腺體和間質)出現在宮腔被粘膜覆蓋以外部位時引起的病癥。其所引起的痛經、慢性盆腔疼痛、不孕等嚴重影響廣大婦女的身心健康甚至威脅到家庭和諧,且其發(fā)病率越來越高,目前,EMT約占育齡婦女的10%-15%,占痛經婦女的40%-60%,不孕患者30%-40%合并EMT,而在EMT患者中,不孕癥的發(fā)病率約40%-60%。EMT雖為良性疾病,卻具有和腫瘤相似的浸潤、侵襲特征,被稱為“良性癌”。異位內膜除了可侵犯盆腔臟器和腹膜(以侵犯卵巢和宮骶韌帶最常見),還可侵犯子宮、子宮直腸陷凹、腹膜臟層、陰道直腸膈等部位,全身任何部位均可能發(fā)病。近年來,國內外學者均對EMT進行了大量的基礎與臨床研究,但至今尚未搞清其明確病因及發(fā)病機制,治療效果也十分有限。EMT的治療方法較多,其中以藥物(內分泌)治療、手術治療和綜合治療為主,但只有切除子宮和雙附件的根治性手術治療效果較為確切,其余治療方法均有很高的復發(fā)率。而切除子宮和雙附件無疑剝奪了廣大育齡期病患的生育權,且使她們徹底喪失內分泌功能,這些都是不容忽視的問題。目前尚未發(fā)現一種治療方法能夠既有較好的治療效果,又無嚴重副作用,針對EMT的大多數藥物均會導致體重增加、肝功能損傷以及絕經期綜合征等副作用,長時間連續(xù)使用會引起嚴重的身心損害。因此,尋找更有效的EMT治療方法成為國內外學者共同關注的問題。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是一種限速酶,可以催化磷脂花生四烯酸合成前列腺素類物質,其催化產生的前列腺素是一類重要的炎癥因子,具有抑制細胞凋亡、抑制免疫監(jiān)視等多種活性,參與炎癥和腫瘤過程,并且可以通過多重途徑引起疼痛。COX-2基因首先被報道與消化道腫瘤發(fā)生有關,隨后的研究發(fā)現COX-2基因通過多種途徑參與了多種實體性腫瘤和EMT的發(fā)生、發(fā)展。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術是一項新近發(fā)展起來的基因治療手段,因其可以特異性剔除或關閉基因的表達,它具備許多優(yōu)勢,比如價格低廉、方便快捷、效率高、穩(wěn)定性強等,已成為探索基因功能的主要手段,在腫瘤和傳染性疾病等的治療方面已取得一定成果。該技術的建立和發(fā)展,無論是在理論上還是實踐上都為EMT的治療提供了一個全新的策略。目的利用si RNA介導的RNA干擾技術靶向沉默COX-2基因,觀察對EMT在位、異位子宮內膜間質細胞(endometrial stroma cell,ESC)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)m RNA、蛋白表達及細胞凋亡的影響,探討COX-2在EMT發(fā)病機制中的作用及si RNA靶向沉默COX-2基因用于治療EMT的可行性。材料與方法1.研究對象選擇2013年12月至2014年9月在河南省鄭州大學第三附屬醫(yī)院(即河南省婦幼保健院)婦科行腹腔鏡或開腹手術的患者70例,其中EMT在位、異位內膜組各30例,非EMT正常對照組10例(患其它婦科良性疾病,子宮內膜炎除外),年齡25-48歲(各組間年齡差異無統(tǒng)計學意義),術前3個月無激素使用史,診斷經腹腔鏡、術后常規(guī)病理檢查證實。所有標本的獲取均經過患者知情同意。手術室中獲取無菌標本后立即置于4℃預冷的含有雙抗(青霉素、鏈霉素各100IU/ml)的無菌DMEM/F-12(FD)培養(yǎng)液中,1小時內送至實驗室在生物安全柜中進行培養(yǎng)。2.試驗方法(1)分離、培養(yǎng)EMT在位、異位ESC各30例,將在位、異位ESC分別分為3組(n=10):si RNA干擾組、陰性對照組和空白對照組,前兩組分別注入COX-2si RNA轉染復合物(含COX-2si RNA 150pmol和脂質體lip 2000 5ul)和陰性對照轉染復合物(含陰性對照si RNA 150pmolul和脂質體lip 2000 5ul),同時分離、培養(yǎng)非EMT的正常ESC 10例作為正常對照組。(2)利用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應技術(Real time RT-PCR)檢測轉染前、后EMT在位、異位ESC和正常對照組ESC COX-2、VEGF及MMP-9基因m RNA的表達水平。轉染后48h,采用上述方法篩選出一條抑制效率最佳的si RNA序列用于后續(xù)試驗;(3)采用蛋白印跡法(Western Blotting)檢測轉染前、后內異癥在位、異位ESC和正常對照組ESC COX-2、VEGF及MMP-9基因蛋白的表達水平。(4)轉染后48h,采用流式細胞儀檢測各組ESC的凋亡水平。結果1.分別培養(yǎng)內異癥在位、異位ESC 35例、32例,最終均成功30例;10例正常子宮內膜間質細胞,均成功。2.3條COX-2 si RNA序列均有一定抑制效果,以si RNA-2抑制效率最佳。3.EMT在位、異位ESC空白對照組COX-2、VEGF、MMP-9 m RNA表達量均高于正常對照組(均P0.05),且異位內膜組明顯高于在位內膜組(P0.05);靶向沉默COX-2基因后,干擾組在位、異位ESC COX-2、VEGF、MMP-9 m RNA表達量與陰性對照組和空白對照組相比,均降低(均P0.05),而后兩者間差異無統(tǒng)計學意義(均P0.05),且異位內膜組較在位內膜組ESC COX-2、VEGF、MMP-9m RNA表達水平下降更明顯(P0.05)。4.EMT在位、異位ESC空白對照組COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達量均高于正常對照組(均P0.05),且異位內膜組明顯高于在位內膜組(P0.05);靶向沉默COX-2基因后,干擾組在位、異位ESC COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達量與陰性對照組和空白對照組相比,均降低(均P0.05),而后兩者間差異無統(tǒng)計學意義(均P0.05),且異位內膜組較在位內膜組ESC COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達水平下降更明顯(P0.05)。5.流式細胞儀檢測結果顯示,si RNA干擾組在位、異位ESC凋亡率較陰性對照組及空白對照組增加(均P0.05),而后兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(均P0.05),且異位內膜組較在位內膜組細胞凋亡更明顯(P0.05)。結論1.COX-2可能在EMT的發(fā)病機制中起重要作用。2.siRNA靶向沉默COX-2基因后,EMT促進因子VEGF、MMP-9的表達明顯受到抑制,細胞凋亡水平明顯增高。3.體外分離、培養(yǎng)原代ESC(在位內膜和異位內膜)是研究EMT的理想實驗模型,si RNA技術為基因的靶向沉默提供了簡單、有效的實驗手段。4.si RNA靶向沉默COX-2基因能否成為治療EMT的一種新型的可行性方法尚需進一步研究。
【關鍵詞】：子宮內膜異位癥 小干擾RNA 環(huán)氧合酶-2 血管內皮生長因子 基質金屬蛋白酶-9 細胞凋亡
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R711.71
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞表14-15
• 1 引言15-18
• 2 材料與方法18-33
• 3 結果33-38
• 4 討論38-44
• 5 結論44-45
• 附圖45-49
• 參考文獻49-53
• 綜述 RNA干擾的機制及其在子宮內膜異位癥基因治療中的應用53-68
• 1 RNAi的發(fā)現53-54
• 2 RNAi的作用機制54
• 3 哺乳動物中的RNAi54-55
• 4 RNAi的分子生物學特性與si RNA的設計55-57
• 5 si RNA的合成與轉染57-59
• 6 RNAi在子宮內膜異位癥中的應用研究59-62
• 7 展望62-64
• 參考文獻64-68
• 致謝68-69
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果69

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 劉木彪;何援利;鐘潔;;靶向NF-κB的siRNA抑制人子宮內膜異位種植的實驗研究[J];廣東醫(yī)學;2009年07期

2 張婷婷;張瑞曉;林明媚;羅璐;吳惠茜;王瓊;周燦權;;膠原酶分離及低速離心結合篩網過濾法純化子宮內膜細胞的研究[J];生殖與避孕;2014年01期

  本文關鍵詞：siRNA靶向沉默COX-2對子宮內膜異位癥在位、異位子宮內膜間質細胞VEGF、MMP-9表達及細胞凋亡的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304516