目的 HOXA10是胚胎黏附的重要調控分子,其表達降低將導致胚胎種植失敗,已知反復種植失敗患者子宮內膜組織中Nur77和HOXA10的表達均降低。本研究旨在探究Nur77是否通過轉錄調節(jié)HOXA10表達參與胚胎黏附的調控。方法 1、通過熒光素酶雙報告基因、染色質免疫共沉淀以及鏈親和素-生物素偶聯(lián)DNA沉淀反應實驗明確Nur77轉錄調控HOXA10的機制;2、采用腺病毒Ad-Flag-Nur77和Ad-siNur77介導Nur77的過表達和抑制表達,并通過Western Blot實驗檢測Nur77對人子宮內膜癌細胞系Ishikawa細胞中HOXA10表達的影響;3、利用Nur77激動劑6-MP和JAR球黏附實驗（人胎盤絨毛癌細胞JAR細胞球黏附于Ishikawa細胞）明確HOXA10介導Nur77對胚胎黏附的作用。結果 熒光素酶雙報告基因、染色質免疫共沉淀和鏈親和素-生物素偶聯(lián)DNA沉淀反應實驗結果證實Nur77直接結合于HOXA10啟動子區(qū)的NBRE反應元件AAAGGTCA（-3075/-3067）,并促進 Ishikawa 細胞中 HOXA10 的轉錄。腺病毒Ad-Flag-Nur7... 

【文章來源】：南京大學江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：60 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１：?Ｎｕｒ７７促進丨ｓｈｉｋａｗａ細?

我們分別構建了含有ＮＢＲＥ位點的啟動子區(qū)片斷報告基因質粒??（ＨＯＸＡＩＯ－Ｌｕｃ）和ＮＢＲＥ位點缺失突變的啟動子報告基因質粒（ＨＯＸＡｌＯ－ｄｅｌ－??Ｌｕｃ）（圖２Ａ）。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，外源性給予Ｎｕｒ７７腺病毒可上??調ＨＯＸＡ１０啟動子活性達２倍以上（圖２Ｂ），但對ＨＯＸＡｌＯ－ｄｅｌ－Ｌｕｃ片段的啟??動子活性無影響（圖２Ｃ）

??為了進一步鑒定ＨＯＸＡＩＯ是否為Ｎｕｒ７７作用的靶基因，我們進行染色質免??疫共沉淀實驗（ＣｈＩＰ－ＰＣＲ）。如圖３Ａ所示，利用針對ＨＯＸＡＩＯ預測結合位點序??列的引物ＰＣＲ擴增，可以從感染Ａｄ－Ｆｌａｇ－Ｎｕｒ７７腺病毒的細胞免疫沉淀復合物??中，擴增出預期大小的ＤＮＡ片段，而對照組不能擴增出目的條帶。這表明Ｎｕｒ７７??與ＨＯＸＡＩＯ啟動子區(qū)直接結合。??如圖３Ｂ所示，我們合成含ＡＡＡＧＧＴＣＡ的ＨＯＸＡＩＯ啟動子的雙鏈寡核苷??酸，且將ＡＡＡＧＧＴＣＡ突變?yōu)椋粒牵粒粒裕裕茫恋膶�，用生物素標記。收集�??染Ａｄ－Ｆｌａｇ－Ｎｕｒ７７?（ｍｏｉ＝１００）的Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞總蛋白，與標記／未標記生物素的??雙鏈寡核苷酸進行鏈親和素免疫沉淀，結果顯示Ｎｕｒ７７與野生型（ＷＴ）片段相??１７??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Regulatory Effect of Estrogen, Progestin and HB-EGF on the Expression of HOXA10 Gene in Ishikawa Cells[J]. 劉雪梅,朱桂金,鐘剛.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2007(04)



本文編號：3041463