目的研究RAS激活物2（RAS protein activator like 2,RASAL2）對宮頸癌HeLa細胞生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制,為探討RASAL2對宮頸癌HeLa細胞的調(diào)控機制奠定實驗基礎(chǔ)。方法1、體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細胞。2、構(gòu)建過表達質(zhì)粒GV40-myc-RASAL2。人RASAL2全長序列擴增,GV40-myc-RASAL2真核表達載體的構(gòu)建和鑒定。3、基因轉(zhuǎn)染:采用轉(zhuǎn)染試劑LIP3000將RASAL2基因轉(zhuǎn)入HeLa細胞中。實驗分為未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、RASAL2基因轉(zhuǎn)染組。4、MTT法檢測過表達RASAL2對HeLa細胞增殖的影響。5、劃痕實驗檢測過表達RASAL2對HeLa細胞遷移的影響。6、Western blotting法檢測RASAL2、上皮型鈣粘蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣粘蛋白（N-cadherin）、SNAIL、ZO-1、WEE1和CCNB1的蛋白表達。7、免疫熒光共定位證實RASAL2和WEE1在宮頸癌HeLa細胞中是否存在共定位。結(jié)果1、GV40-myc-RASAL2重組質(zhì)粒鑒定:PCR鑒定和測序分析表明GV40-m... 

【文章來源】：錦州醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：43 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

GV40-myc-RASAL2質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定

五、Western blot 檢測 E-cadherin，SNAIL,ZO-1，N-cadherin蛋白表達。RASAL2 基因轉(zhuǎn)染 46 小時之后收集未轉(zhuǎn)染組、GV40 空載體轉(zhuǎn)染組，GV40-myc-RASAL2 轉(zhuǎn)染組三組細胞。Western blot 檢測關(guān)于侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白。如圖 4 所示，在 HeLa 細胞中，GV40 空載體轉(zhuǎn)染組相較未轉(zhuǎn)染組無明顯變化（p>0.05）。過表達 RASAL2 之后,N-cadherin，SNAIL,ZO-1 蛋白的表達明顯低于未轉(zhuǎn)染組和 GV40 空載體轉(zhuǎn)染組(p<0.01)；但 E-cadherin 蛋白表達明顯高于未轉(zhuǎn)染組和 GV40 空載體轉(zhuǎn)染組(p<0.01)。A B

圖 5 A .RASAL2，WEE1，CCNB1 的蛋白表達情況 B. RASAL2，WEE1，CCNB1 灰度值比值結(jié)果七、免疫熒光實驗檢測 RASAL2 和 WEE1 在 HeLa 中共定位情況采用免疫熒光共定位技術(shù)檢測RASAL2和WEE1在HeLa細胞中的共定位。結(jié)果表明，RASAL2 在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，但主要表達在細胞核。WEE1在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，也主要表達在細胞核中。免疫熒光結(jié)果顯示RASAL2 和 WEE1 在 HeLa 細胞主要共定位在細胞核中（圖 6）


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