子宮損傷后修復缺陷是導致女性不育、流產(chǎn)、早產(chǎn)、子宮破裂發(fā)生的主要原因之一,不僅破壞女性生殖能力,嚴重時甚至危及母兒生命安全。因此,促進子宮損傷的修復愈合對維持女性生殖健康有重要意義。然而,損傷修復期的人類子宮組織獲取受限,這不僅影響子宮損傷修復及重塑機制相關(guān)研究的深入,也阻礙了子宮損傷性疾病臨床診治的進展,因此動物實驗成為探索這一未知領(lǐng)域的研究工具。組織工程是一門以細胞生物學、材料科學與再生微環(huán)境相結(jié)合,進行體外或體內(nèi)組織器官功能性修復、器官重構(gòu)研究的新興學科。組織工程的興起為人體組織缺損導致的功能障礙提供了理想的治療方案。近年來有關(guān)修復和再生的組織工程研究越來越多,其中膠原蛋白因良好的組織相容性、低免疫源性和易降解等生物學特性被推廣和應用。采用膠原蛋白支架負載細胞或生物活性因子促進損傷組織修復也收到了滿意的臨床療效。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是一種具有多種生物學功能的細胞因子,近年來研究發(fā)現(xiàn),LIF有效地促進了骨骼肌、神經(jīng)和心肌等多種組織器官的再生和修復。而LIF在子宮組織表達豐富,子宮內(nèi)膜腺上皮LIF的表達是子宮內(nèi)膜接受胚胎著床不可或缺的分子;此外,LIF在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和子宮肌層均有表達,提示LIF可能具有促進子宮組織損傷修復的生物學功能。本研究對此進行了初步探索,研究第一部分,采用大鼠子宮壁全層損傷動物模型,將負載不同劑量LIF膠原支架移植至子宮壁全層損傷的缺損區(qū)域,與PBS膠原支架修復相比較。通過術(shù)后1-2周損傷區(qū)域修復變化的對比分析,探索LIF促進子宮損傷修復的可能性及有效劑量,通過對比分析術(shù)后1周大鼠子宮損傷修復局部的炎癥細胞和炎癥因子,研究LIF調(diào)控局部炎癥反應與促進損傷修復的關(guān)系;研究的第二部分,采用膠原支架負載0.5μg LIF或等容量PBS修復大鼠子宮壁全層損傷,通過對比分析術(shù)后2-12周子宮組織結(jié)構(gòu)修復和重塑改變,驗證LIF促進子宮壁損傷修復的有效性;進一步通過妊娠實驗對比分析修復子宮的功能差異。本研究發(fā)現(xiàn)和明確了LIF促進大鼠子宮損傷修復的生物學功能,為LIF應用于子宮損傷性疾病的臨床治療提供了動物實驗基礎(chǔ)。目的:1.通過移植負載LIF或PBS的膠原支架于大鼠子宮壁全層損傷模型的子宮缺損區(qū)域,對比觀察不同濃度LIF或PBS對子宮損傷修復的效應,探索LIF修復子宮損傷的可行性及最佳劑量,并進一步對比研究LIF在損傷修復過程中的可能機制。2.采用負載LIF或PBS的膠原支架修復大鼠子宮壁全層損傷,通過術(shù)后12周的長期觀察,明確LIF具有促進損傷子宮結(jié)構(gòu)和功能修復的生物學功能。方法:1.參照本實驗室前期建立的大鼠子宮壁全層損傷動物模型,在大鼠子宮體中段系膜對側(cè)切除1.5 cm長、0.5 cm寬(相當于子宮周徑2/3)子宮壁全層缺損。前期研究已證明,大鼠不能自然功能性修復該大小的子宮壁損傷。2.24只成年雌性SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠隨機分為4組:PBS/膠原支架對照組,0.25μg LIF/膠原支架組,0.5μg LIF/膠原支架組,1.0μg LIF/膠原支架組,子宮壁全層損傷后,分別將負載0.25μg、0.5μg、1.0μg LIF或PBS的1.5 cm×0.5cm膠原支架縫合于缺損區(qū)(LIF各組6只大鼠,12只子宮,n=12;PBS組6只大鼠,12只子宮,n=12,共48只子宮),術(shù)后2周對損傷子宮行大體解剖觀察、HE和免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色組織學觀察,評估子宮壁的形態(tài),計數(shù)膠原支架上的細胞和新生血管數(shù)量。IHC主要用于檢測v WF(von-Willebrand-factor,v WF)的表達。3.10只雌性SD大鼠隨機分為兩組,包括LIF/膠原支架組5只(子宮損傷后,用負載0.5μg LIF的膠原支架縫合缺損),PBS/膠原支架組5只(用PBS浸潤的膠原支架膜縫合缺損)(PBS:n=10;LIF:n=10)。術(shù)后1周,取損傷區(qū)域子宮組織,對損傷子宮組織切片進行HE、CD45的IHC和免疫熒光染色,對比兩組炎癥細胞變化;收集受損部位的子宮組織,提取總RNA并通過逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量PCR分析檢測修復組織內(nèi)炎性細胞因子(IL-10,IL-12,IL-6,IL-1β,TNF-α和TGF-β1)m RNA水平。4.明確LIF修復損傷子宮的可行性及有效劑量后,48只雌性SD大鼠隨機分為兩組:包括LIF/膠原支架組(子宮損傷后,用負載0.5μg LIF的膠原支架縫合缺損),PBS/膠原支架組(用等容量PBS浸潤的膠原支架縫合缺損)。分別在術(shù)后2周(PBS:n=12;LIF:n=12),4周(PBS:n=12;LIF:n=12),8周(PBS:n=12;LIF:n=12)和12周(PBS:n=12;LIF:n=12),進行子宮通暢實驗和大體檢查,通過組織切片IHC染色a平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,a-SMA)、細胞角蛋白7(Cytokeratin 7,CK7)評估子宮平滑肌和子宮內(nèi)膜上皮再生情況。5.雌性SD大鼠25只分為兩組,包括LIF/膠原支架組15只,PBS/膠原支架組10只(LIF:n=30;PBS:n=20),子宮壁全層損傷后采用兩種不同方法修復,觀察滿8周,然后將兩組動物與雄性SD大鼠配對,在妊娠15-19日剖視并計數(shù)妊娠子宮數(shù)、子宮壁損傷處的著床情況和胚胎數(shù)以評估LIF對損傷子宮妊娠能力的影響。結(jié)果:1.術(shù)后短期對比觀察:(1)子宮損傷局部細胞化和血管再生:術(shù)后2周,各組損傷區(qū)域未降解的膠原支架中可見細胞浸潤,局部無明顯炎癥反應,LIF各組的膠原支架內(nèi)細胞數(shù)明顯多于PBS組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001);IHC血管密度:0.25μg和0.5μg LIF組血管密度均明顯高于PBS組(P0.001)。(2)膠原支架內(nèi)炎癥細胞和炎性因子變化:術(shù)后1周,HE染色顯示LIF和PBS兩組膠原支架均未降解,未發(fā)現(xiàn)周圍組織的排斥反應,此時損傷區(qū)域膠原支架中均見炎性細胞浸潤。CD45免疫組化和免疫熒光染色顯示,LIF組CD45陽性細胞(炎癥細胞)浸潤數(shù)量少于PBS組,LIF組CD45的AOD值較PBS組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。損傷子宮組織內(nèi)炎性因子IL-10,IL-12,IL-6,IL-1β,TNF-α和TGF-β1m RNA表達水平檢測結(jié)果:LIF/膠原支架修復子宮組織中IL-10的表達水平較對照組上調(diào)2.74倍(P0.01);而IL-12的表達下調(diào)2.09倍(P0.05)。兩組IL-6,IL-1β,TNF-α和TGF-β1的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.術(shù)后長期對比觀察:(1)子宮愈合大體外觀:術(shù)后8周和12周,LIF/膠原支架修復手術(shù)區(qū)域外觀上與周圍組織相似,雖然通暢實驗提示兩組子宮均無梗阻,但PBS/膠原支架組修復區(qū)域可見瘢痕及局部凹陷。(2)子宮平滑肌再生修復:LIF組術(shù)后8、12周α-SMA陽性面積比例與術(shù)后2周比較均顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);術(shù)后8和12周,LIF/膠原支架組的α-SMA陽性面積比例均顯著高于同期PBS/膠原支架組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。(3)子宮內(nèi)膜再生修復:各組術(shù)后4周至12周子宮內(nèi)膜厚度無明顯變化,組間比較,LIF組子宮內(nèi)膜厚度較PBS組增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);術(shù)后8周和12周,LIF組的子宮內(nèi)膜再生腺體數(shù)量明顯高于PBS組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。3.妊娠實驗結(jié)果兩組平均妊娠率和每個子宮妊娠的平均胚胎數(shù)目比較,LIF/膠原支架組高于PBS/膠原支架組,平均妊娠率(86.67%vs 60.00%)和平均胚胎數(shù)(3.63±0.34vs 2.35±0.51),差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。LIF/膠原支架組中有10個子宮(10/30)在修補區(qū)域有胚胎著床,而PBS/膠原支架組在子宮手術(shù)區(qū)域僅有3個子宮(3/20)有胚胎著床,整個妊娠期兩組均無子宮破裂發(fā)生。結(jié)論:1.5×0.5cm膠原支架負載LIF 0.5μg能夠促進大鼠子宮壁全層損傷修復,在損傷修復早期,LIF主要表現(xiàn)出促進損傷區(qū)域的細胞化、促進局部血管再生功能,LIF的作用呈現(xiàn)劑量依賴性;LIF對子宮肌層和子宮內(nèi)膜腺體再生修復作用顯著;LIF修復的子宮組織結(jié)構(gòu)接近正常子宮,能夠接受胚胎和完成妊娠,妊娠率和胚胎數(shù)顯著提高;在子宮損傷修復的炎癥期,LIF抑制子宮損傷局部炎細胞浸潤和促炎因子釋放,同時促進抑炎因子在損傷組織的表達,對損傷后炎癥反應的調(diào)控可能是LIF促進子宮壁全層損傷修復的重要機制之一。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R711
【部分圖文】：
圖 1 組織損傷修復 3 階段研究報道了一種新型大鼠子宮壁重建模型，并采用胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）
個正常動情周期（4-5 天）的雌鼠納入實驗研究，并于動情間期進行手術(shù)處理。實驗鼠共計 24 只(48 個子宮)，每組各 6 只（12 個子宮）。圖2 雌鼠動情周期陰道涂片鏡下觀察我們采用前期建立的大鼠子宮壁全層損傷的動物模型，切除大鼠子宮壁1.5cm 長×0.5cm 寬(子宮周徑 1/2)，保留系膜側(cè)的全層缺損，每個子宮 1 個手術(shù)缺損創(chuàng)面，使用相應大小的膠原支架縫合到大鼠子宮壁缺損區(qū)域，見示意圖（圖3），前期實驗室研究結(jié)果已經(jīng)證實了膠原支架適用于細胞的粘附和維持組織的固有形態(tài)，作為子宮再生細胞外基質(zhì)的適用性。
使用相應大小的膠原支架縫合到大鼠子宮壁缺損區(qū)域，見示意圖（圖3），前期實驗室研究結(jié)果已經(jīng)證實了膠原支架適用于細胞的粘附和維持組織的固有形態(tài)，作為子宮再生細胞外基質(zhì)的適用性。
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本文編號：
2863488
