目的:借助生物信息學(xué)及相關(guān)分析工具,對(duì)不同膳食油脂條件(高橄欖油飲食和對(duì)照飲食)喂養(yǎng)下的裸鼠宮頸癌轉(zhuǎn)移瘤組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)分析,篩出與宮頸癌移植瘤增殖相關(guān)的差異表達(dá)基因,對(duì)這些上調(diào)或下調(diào)的差異基因進(jìn)行相關(guān)功能注釋分析及通路分析,通過以上這些生信分析結(jié)果,對(duì)差異表達(dá)基因可能的生物功能加以預(yù)測(cè)。通過相應(yīng)生物信息學(xué)軟件及算法在這些差異表達(dá)基因中篩選出核心基因,或是感興趣的目的基因,以期找到能夠解釋高橄欖油飲食促進(jìn)宮頸癌移植瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因,并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。方法:第一部分:選取4周齡BALB/c背景的裸鼠,隨機(jī)分為對(duì)照飲食組(Control Diet,CD)和高橄欖油飲食組(High Olive Oil Diet,OD),并用Hela細(xì)胞在裸鼠皮下注射造模。造模6周后收集腫瘤樣本,并進(jìn)行拍照及測(cè)量。并對(duì)腫瘤病理切片進(jìn)行HE和PCNA染色。在體外利用橄欖油中主要成分油酸處理Hela細(xì)胞,利用長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)油酸處理?xiàng)l件下細(xì)胞增殖狀態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè),并利用EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)油酸處理?xiàng)l件下細(xì)胞群中進(jìn)行處于DNA合成狀態(tài)的細(xì)胞比例。第二部分:利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選對(duì)照組和高橄欖油飲食組移植瘤樣本中DEGs(Differentially Expressed Genes),然后用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)上調(diào)和下調(diào)的基因分別進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析,探索這些差異基因可能的相關(guān)的生物學(xué)功能及關(guān)鍵通路信息。為了進(jìn)一步挖掘DEGs之間的相互聯(lián)系,應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction,PPI)的構(gòu)建,并將分析結(jié)果數(shù)據(jù)通過Cytoscape軟件將其可視化并利用其CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)(代表一個(gè)基因)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?節(jié)點(diǎn)度)進(jìn)行計(jì)算,得到處于PPI網(wǎng)絡(luò)中最核心地位的一組樞紐基因(Hub gene),同時(shí)用MCODE插件尋找PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊,根據(jù)設(shè)置參數(shù)得到三個(gè)重要模塊及其包含的核心蛋白。最后,為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選的DEGs準(zhǔn)確性,從生信分析得到一組核心基因組中,隨機(jī)選取了5個(gè)DEGs,采用RT-qPCR方法驗(yàn)證了它們兩組樣本組織中mRNA表達(dá)水平差異。結(jié)果:第一部分:裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高橄欖油飲食組皮下腫瘤體積及重量均超過對(duì)照飲食組6倍(P0.05),同時(shí)腫瘤組織HE染色后可見OD組切片呈現(xiàn)更高的異質(zhì)性,免疫組化分析揭示OD組中PCNA陽性細(xì)胞的顯著增加。長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)Hela細(xì)胞增殖狀態(tài)監(jiān)測(cè)顯示48h時(shí),油酸處理組細(xì)胞融合度為(72.8±1.6)%,較對(duì)照組(64.7±5.5)%顯著增高(P0.05),EdU陽性細(xì)胞陽性率在油酸處理組為(36.6±1.1)%,較對(duì)照組(31.9±1.1)%明顯增加(P0.05)。第二部分:不同膳食脂質(zhì)喂養(yǎng)條件下兩組腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序總共得到648個(gè)DEGs,其中包括155個(gè)上調(diào)的DEGs和493個(gè)下調(diào)的DEGs。GO功能分析和KEGG通路途徑富集分析這些DEGs主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控(如EGR1和FOXN2)和細(xì)胞增殖(如TGFB2和COL4A3)。用STRING在線蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫將符合標(biāo)準(zhǔn)的DEGs構(gòu)建成PPI網(wǎng)絡(luò)后,利用Cytoscape的MCODE插件得出三個(gè)重要的亞網(wǎng)絡(luò),并且根據(jù)節(jié)點(diǎn)度的大小(節(jié)點(diǎn)度8),由高到低得到15個(gè)核心蛋白,并將這15個(gè)核心蛋白映射到模塊上,可見相當(dāng)一部分核心蛋白處于上述的模塊中。通過實(shí)時(shí)定量PCR分析確認(rèn)包括JUN,TIMP3,OAS1,OASL和EGR1的中樞基因。RT-qPCR檢測(cè)的5個(gè)DEGs(JUN,TIMP3,OAS1,OASL和EGR1)的變化趨勢(shì)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)論:高橄欖油飲食喂養(yǎng)在體內(nèi)有助于宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng),并且油酸在體外可提升其的增殖潛能,隨后全面的生物信息學(xué)分析顯示,不同膳食喂養(yǎng)條件下的小鼠移植瘤組織之間存在明顯的基因表達(dá)模式差異,這種表達(dá)模式差異具體體現(xiàn)在一組重要的核心基因的表達(dá)差異及相關(guān)信號(hào)通路變化,這些核心基因?yàn)槲覀冞M(jìn)一步研究宮頸癌潛在的機(jī)制提供了的方向,而且它們有望成為宮頸癌診斷和治療潛在的靶點(diǎn),當(dāng)然這些核心基因的具體機(jī)制我們?nèi)匀恍枰ㄟ^進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來證明。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

18橄欖油飲食喂養(yǎng)加劇 Hela 宮頸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)。（A）兩組模型小鼠腫瘤拍照?qǐng)D片（B）6 周皮下瘤測(cè)量數(shù)據(jù)繪制生長(zhǎng)曲線（C）腫瘤組織重量比較，*Pigure 1 High olive oil diet feeding promotes the growth of xenografts in nude mice. presentative graph of tumours formed by the implantation of HeLa cells under diffes (B) Analysis of tumour growth curves over a 6-week time course (C) Tumour weigdifferent diet groups of nude mice, *P < 0.05.高橄欖油飲食喂養(yǎng)組腫瘤具有更高的異型性和增殖狀態(tài)為了評(píng)估不同膳食營(yíng)養(yǎng)下的腫瘤組織異質(zhì)性以及腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)，將組織切片進(jìn)行了 H＆E 染色和免疫組化 PCNA 染色。如圖 2 所示，可見相比，OD 組腫瘤切片呈現(xiàn)出核色素過度增已經(jīng)和細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比率 OD 組腫瘤更差的分化和更高的異質(zhì)性（圖 2 A）。同樣，IHC 結(jié)果表 PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)比例顯著增加，提示細(xì)胞增殖更活躍（P<0.001，圖

圖 2 高橄欖油飲食下腫瘤呈現(xiàn)更高的異型性和增殖狀態(tài)。（A）腫瘤切片 HE 染色。（B）免疫組化腫瘤組織 PCNA 染色（C）PCNA 染色陽性細(xì)胞比例靶圖，***P < 0.001。Figure 2 High olive oil diet feeding group xenograft tissues exhibited poor differentiation,higher heterogeneity and more active proliferation. (A) H&E-stained sections of xenografts (B)Immunohistochemical staining of tumour sectios using an anti-PCNA antibody (C)quantification of the percentage of the PCNA-positive area, ***P < 0.001.2.3 體外實(shí)驗(yàn)油酸促進(jìn)宮頸癌 Hela 細(xì)胞增殖鑒于油酸（Oleic acid, OA）是橄欖油中含量最豐富（超過 70％）、最重要的功能性營(yíng)養(yǎng)成分，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中采用 OA 來探索橄欖油對(duì)癌細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Negative Control, NC）和 OA 處理組（OA 濃度為 10μM）。對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的檢測(cè)應(yīng)用了長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像系統(tǒng)（Incucyte ZOOM）和 EdU實(shí)驗(yàn)，如圖 3 所示：使用 IncuCyte ZOOM 對(duì)兩組細(xì)胞增殖狀態(tài)進(jìn)行近 2 天的動(dòng)態(tài)觀察，將拍照統(tǒng)計(jì)得到的融合度數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線作圖�？梢� 48h 時(shí)，OA 組細(xì)胞融合

20圖 3 體外實(shí)驗(yàn)油酸促進(jìn)宮頸癌 Hela 細(xì)胞增殖。（A）Incucyte ZOOM 檢測(cè) OA 處理后細(xì)胞增殖曲線及 48h 時(shí)兩組細(xì)胞融合情況拍照。（B）EdU 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) DNA 合成情況；EdU 染色（紅色）、細(xì)胞核用 Hoechst33342 染色（藍(lán)色）；并對(duì) 48h 時(shí) EdU 陽性細(xì)胞比例進(jìn)行靶圖定量，*P < 0.05，***P < 0.001。Figure 3 OA accelerates HeLa cell proliferation in vitro. (A) Growth curves for HeLa cellstreated with or without OA were analysed using an IncuCyte incubator microscope and themean confluence values were compared at 48 hrs (B) DNA synthesis of HeLa cells subjected tothe EdU incorporation assay. EdU staining (red). Cell nuclei were stained with Hoechst33342(blue). The quantification of EdU-positive cells was conducted macroscopically and wasexpressed as a percentage relative to the control cells, *P < 0.05, ***P < 0.001.
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本文編號(hào)：2847903