目的:本實驗初步探討自噬對腫瘤壞死因子凋亡相關誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)誘導宮頸癌Hela細胞凋亡的影響,為將TRAIL應用于宮頸癌治療提供新的策略。方法:⑴體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細胞株。⑵用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測不同濃度TRAIL作用及TRAIL與3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或氯喹(chloroquine,CQ)聯(lián)合作用的Hela細胞增殖活性,倒置顯微鏡下觀察Hela細胞的形態(tài)變化。⑶免疫熒光法(immunofluorescence,IF)對微管相關蛋白1輕鏈3B(microtubule associated protein 1 light chain3B,LC3B)、p62進行熒光染色,并在熒光顯微鏡下觀察;用DAPI染色觀察Hela細胞凋亡。⑷用蛋白質(zhì)印跡法檢測LC3B、p62及聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerse,PARP)蛋白的表達水平。⑸數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0軟件,計量資料以均數(shù)±標準差表達,組間均數(shù)比較用方差分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果:⑴TRAIL可抑制Hela細胞的增殖活性:不同濃度TRAIL處理Hela細胞48 h,Hela細胞的增殖活性隨濃度增大而下降,半數(shù)抑制率濃度為6.54 ng/m L,選擇TRAIL藥物濃度在IC50值以下,2.0 ng/m L作為后續(xù)實驗濃度。⑵3-MA或CQ增強TRAIL對Hela細胞的增殖抑制作用:TRAIL與3-MA或CQ聯(lián)合作用于Hela細胞其增殖活性與單獨使用TRAIL或3-MA或CQ組相比明顯降低,P0.05,差異有顯著意義。⑶TRAIL可誘導Hela細胞發(fā)生自噬:TRAIL作用于Hela細胞,Hela細胞內(nèi)LC3聚集體增多,LC3熒光點及LC3Ⅱ蛋白水平升高,說明TRAIL可誘導Hela細胞內(nèi)自噬體的形成;TRAIL與CQ聯(lián)合作用于Hela細胞較單獨TRAIL或CQ作用,LC3聚集體顯著增加,LC3熒光點及LC3Ⅱ蛋白水平顯著升高,證實LC3聚集是由自噬活性增強引起的;3-MA、TRAIL與3-MA聯(lián)合作用于Hela細胞,LC3熒光點及LC3Ⅱ蛋白水平降低,提示3-MA可抑制自噬。TRAIL組與control組相比,p62熒光點及蛋白水平明顯降低;加入自噬抑制劑組(CQ、TRAIL+CQ、3-MA、TRAIL+3-MA組)p62熒光點及蛋白水平較TRAIL組升高�？傊�,TRAIL可誘導Hela細胞發(fā)生自噬;3-MA、CQ可抑制細胞自噬。⑷3-MA或CQ明顯增強TRAIL誘導的Hela細胞凋亡:DAPI染色發(fā)現(xiàn),TRAIL與3-MA或CQ聯(lián)合作用Hela細胞的凋亡率與單獨使用TRAIL或3-MA或CQ比較明顯增高,P0.05,差異有統(tǒng)計學意義。⑸3-MA或CQ增強TRAIL誘導的凋亡相關蛋白的表達:TRAIL與3-MA或CQ聯(lián)合作用于Hela細胞,cleavage-PARP的表達較TRAIL組顯著增加,P0.05差異有意義。結論:1.TRAIL可抑制Hela細胞的增殖活性,并且呈劑量依賴性。2.TRAIL在誘導Hela細胞凋亡的同時也可誘導自噬的發(fā)生,且自噬對Hela細胞的存活起保護作用。3.抑制自噬可增強TRAIL誘導的Hela細胞凋亡。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R737.33
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
常用縮寫詞中英文對照表
前言
1 材料與方法
    1.1 細胞株
    1.2 主要試劑和儀器
    1.3 主要試劑的配制
    1.4 實驗方法
    1.5 統(tǒng)計學分析
2 結果
    2.1 TRAIL抑制Hela細胞的增殖活性
    2.2 3-MA或CQ明顯增強TRAIL對Hela細胞的增殖抑制作用
    2.3 TRAIL誘導Hela細胞發(fā)生自噬
    2.4 3-MA或CQ明顯增強TRAIL誘導的Hela細胞凋亡
    2.5 3-MA或CQ增強TRAIL誘導的凋亡蛋白的表達
3 討論
4 結論
參考文獻
綜述
    參考文獻
致謝
在學期間參與或承擔的科研課題與研究成果
個人簡歷

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本文編號：2831105