【摘要】：第一部分 體外受精出生小鼠心肌組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達的變化目的:評估體外受精(IVF)出生小鼠從幼年到老年的心肌組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)各基因及其心血管效應基因表達變化。材料及方法:1.利用C57BL/6J小鼠建立IVF及體內受精小鼠(in vivo)模型。出生小鼠飼養(yǎng)至3周,10周及1.5年時,分別給予安樂死獲取兩組小鼠的心臟組織。2.TRIZOL法抽提小鼠心肌組織中的總RNA,逆轉錄成cDNA后,通過熒光定量PCR技術,測定兩組中RAS系統(tǒng)基因Ren1,Ren2,Ace,Ace2,Agt,Agtr1a,Agtr1b,Agtr2,及其心血管效應基因Col1a1,Col1a2,Col3 and Ctgf的mRNA相對表達量。3.用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取心肌組織的蛋白質,采用BCA法進行蛋白濃度測定,Western blot技術檢測AGTR1,AGTR2,CTGF and COL3蛋白質的相對表達量。結果:1.在3周齡時,IVF組的Ren1,Ace,Agtr1a,Col3和Ctgf的mRNA表達水平顯著高于體內組。同樣,在10周齡時,IVF組中的Ace,Agt,Agtrlb,Agtr2,Col1al和Col3的mRNA表達水平也明顯高于體內組。當達到1.5歲時,IVF組Ren1,Ace,Agtr1b,Col3和Ctgf的mRNA表達水平仍然高于體內組。2.在3周齡時,IVF組AGTR1和CTGF的蛋白表達水平與體內組相比顯著增加。10周齡時兩組中AGTR1,AGTR2和CTGF蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義。在老年時,IVF組AGTR1蛋白表達明顯上調,但其余蛋白表達水平無顯著差異。結論:IVF出生小鼠幼崽期,心肌組織中RAS系統(tǒng)部分基因及其心血管發(fā)育和功能調節(jié)相關效應基因的表達水平升高,且這種改變可以持續(xù)存在,直到老年階段,提示ART過程可影響出生小鼠心肌組織RAS系統(tǒng)基因表達,并可能是IVF后代心血管畸形或功能障礙的潛在危險因素之一。第二部分 體外受精出生小鼠心肌組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達改變機制研究目的:研究IVF出生小鼠心肌組織中RAS改變的調控機制,闡明IVF作用因素可能影響子代成年后心血管的關鍵作用環(huán)節(jié),探究基因相互作用機制,為降低IVF出生子代的心血管疾病風險研究提供思路和途徑。材料及方法:1.使用DNeasy血液和組織試劑盒提取兩組小鼠心肌組織中的基因組DNA。對基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾,并使用靶向捕獲測序技術,檢測Col1l1,Ctgf以及印記基因的啟動子區(qū)域CpG島的甲基化情況。2.提取小鼠心肌組織中的總RNA,逆轉錄后,通過miRNA芯片檢測老年時期兩組小鼠中的miRNA表達譜。3.在芯片篩出的差異miRNA中,聚焦在miRNA數(shù)據(jù)庫預測后分別與Col3a1,Agtr1a和Col1a2相互作用的miRNA:miR-100,miR-297和miR-758作為檢測目標。通過定量PCR技術,驗證miR-100,miR-297,and miR-758在兩組中的表達情況。4.通過構建分別帶有AGTR1 3'-UTR或AGTR1 3'-UTR突變片段并將其插入pmiR-RB-Report的熒光素酶報告基因載體,分別轉染miR-297a-3pmimic或陰性對照(NC)到293T細胞,檢測AGTR1與miR-297的相互作用情況。5.培養(yǎng)H9c2心肌細胞,轉染microRNA mimic,在心肌細胞中過表達miR-297。6.細胞轉染后48小時,用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取心肌細胞中的蛋白質,采用BCA法進行蛋白濃度測定,Western blot技術檢測AGTR1,CTGF和COL3蛋白質的相對表達量。7.細胞轉染后48小時,向培養(yǎng)物中加入5-乙炔基-20-脫氧尿苷(EdU)(10μM),并使細胞再生長2小時。分別使用流式細胞術和共聚焦顯微鏡觀察H9c2心肌細胞的增殖情況。結果:1.與體內組相比,IVF組3周時Ctgf的平均DNA甲基化水平顯著下降。10周時Ctgf的CpG位點18和Ctgf在老年時期的CpG位點2和14的甲基化水平在IVF組中顯著降低。2.在3周齡時,Col1a1的CpG位點4的甲基化水平在IVF組中顯著降低。Col1a1在10周時的CpG位點6和8以及Col1a1在老年時期的CpG位點1,2和3的甲基化水平在IVF組中顯著降低。3.在3周齡時,兩組之間未發(fā)現(xiàn)miR-100,miR-297和miR-758的表達水平顯著改變。而在第10周,miR-100和在IVF組中觀察到miR-758與體內組相比顯著升高。在老年時期也有類似的趨勢,發(fā)現(xiàn)IVF組miR-100,miR-297和miR-758的表達水平顯著增加。4.miR-297a-3p模擬物顯著調節(jié)pmiR-AGTR1-WT載體的螢光素酶活性。然而,pmiR-AGTR1-Mut載體的熒光素酶活性不受miR-297a-3p模擬物的影響。這些結果表明miR-297a-3p直接靶向AGTR1并調節(jié)其表達。5.miR-297過表達48 h,后AGTR1和CTGF蛋白表達明顯增加,表明miR-297可與AGTR1相互作用,進一步促進CTGF蛋白的表達。6.與對照組相比,miR-297過表達能夠顯著促進心肌細胞增殖。7.IVF組的Igf2r在1.5年時的平均DNA甲基化水平顯著降低;IVF組的Mest在10周時的平均DNA甲基化水平有明顯升高;IVF組的Snrpn在3周齡時的平均DNA甲基化水平顯著降低。結論:1.IVF出生小鼠心肌細胞Ctgf和Col1a1基因表達水平升高可能是由于其Ctgf和Col1a1基因啟動子區(qū)CpG位點甲基化水平降低所致。2.miR-100,miR-297和miR-758可能參與了 IVF出生小鼠心肌細胞COL3,AGTR1和COL1表達的調控,且miR-297表達水平改變可能調節(jié)心肌細胞增殖活性。3.IVF可能通過改變表觀遺傳學的調控,導致的IVF出生小鼠RAS表達改變,該機制可能是IVF后代心血管畸形或功能障礙的潛在危險因素。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714
【圖文】：

第？部分引言逡逑其調節(jié)功能改變的傾向［９］，諸如血管收縮壓升高、空腹血糖值上升一類成年性心逡逑血管疾病易感因素也已見報道（圖１．１）。而ＡＲＴ小鼠模型不僅顯示其出生子代存逡逑在血管內皮調節(jié)功能和血脂代謝能力的改變［１０，邋１１］，而且顯示相關的改變與部分逡逑基因的甲基化修飾改變和表達異常有關。逡逑１９％年Ｂａｒｋｅｒ等提出“成年疾病的胎兒起源學說”，該學說認為成年后的心血管逡逑疾病及糖尿病等一些相關疾病來源于胎兒發(fā)育過程中，是機體對體外環(huán)境不良刺逡逑激的適應性反應［１２］�，F(xiàn)代ＡＲＴ技術通過藥物刺激實現(xiàn)多個卵子同步成熟，利用體逡逑外培養(yǎng)和顯微操作完成精卵細胞受精結合以及早期胚胎的生長發(fā)育，其在消除患逡逑者生殖障礙病因的同時，涉及了生殖細胞增殖、受精、發(fā)育乃至分化的多個自然逡逑過程，存在導致配子、受精卵和胚胎發(fā)生不良應激的可能性［１３］。受精及胚胎時期，逡逑特別是著床前胚胎

漿中血管緊張素原（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ，邋Ａｇｔ）水解轉化為血管緊張素Ｉ邋（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋Ｉ，逡逑Ａｎｇｌ），然后，通過血管緊張素轉化酶（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ，邋ＡＣＥ）將逡逑其水解成Ａｎｇｌｌ－ＩＸ邋（圖１．２），使心率加快，血管收縮，心臟輸出量增加；加上繼逡逑發(fā)醛固酮釋放，腎小血管血流減少和鈉離子重吸收，水鈉潴留，進而增加血容量，逡逑維持或升高血壓，完成機體的應急反應［１５］。另一方面，在血管壁、心臟等組織也逡逑有廣泛活躍的腎素－血管緊張素原合成和分泌，它們以旁分泌和（或）自分泌方式逡逑調節(jié)維護心血管的功能和結構［１６］。全身或局部的多種刺激可通過局部的Ｒｅｎ釋放，逡逑激活心血管系統(tǒng)的ＲＡＳ系統(tǒng)，導致局部以Ａｎｇｌｌ為主的血管緊張素水平的升高釋逡逑放，后者與血管內皮和心肌細胞內具七個跨膜結構域的Ｇ蛋白偶聯(lián)血管緊張素受逡逑體１型受體（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋ｔｙｐｅ邋１邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ，邋ＡＴ邋１邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合并活化，調節(jié)心血管逡逑細胞的基因表達和功能［１７］。既往研究表明

達水平逡逑使用定量ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＲＡＳ組分中的基因及其相應的效應基因的表達水平，逡逑以研究ＩＶＦ對子代心肌中與心血管系統(tǒng)健康相關基因表達的影響（圖３．１）。在該逡逑研究中檢測的ＲＡＳ組分中的基因包括Ｚｃｅ２，邋NB鞏和＾／ｒ２。逡逑ＲＡＳ的相應效應基因包括Ｃｏ／ｋｉ，邐Ｃｏ／３和Ｃｆｇ／；在３周齡時，ＩＶＦ組中逡逑ｊｃｅ，邋Ｊｇｒｒ／ａ，邋和Ｃ／ｇ／＂的ｍＲＮＡ表達水平與體內組相比顯著增加（１．１４倍，Ｐ逡逑＜０．０５；邋２．１５邋倍，Ｐ〈分別為邋０．０５；邋２．０１邋倍，尸邋＜０．０５；邋１．６２邋倍，Ｐ邋＜０．０５；和邋２．１３邋倍，Ｐ邋＜０．０５邋）逡逑（圖邋３．１Ａ）。Ｃｏ／／ａｉ邋和邋Ｃ＜？／７ａ２邋在邋ＩＶＦ邋組和體內組之間的逡逑ｍＲＮＡ表達水平?jīng)]有觀察到顯著的統(tǒng)計學差異（尸＞０．０５）（圖３．１Ａ）。在１０周逡逑齡時，與體內組相比，ＩＶＦ組中Ｊｃｅ，邋ｄ�。茫铮椋妫欤停茫铮车模恚遥危铃义媳磉_水平也顯著增加（１．７４倍，尸＜０．０５；邋２．０４倍，尸＜０．０５；邋１．７９倍，尸＜０．０５；邋２．０８逡逑倍

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9 沈滌非;袁園;吳青青;鄧偉;倪健;唐其柱;;心抑瘤素M及其受體在壓力負荷致心肌肥厚小鼠心肌組織中的表達及意義[J];山東醫(yī)藥;2016年33期

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本文編號：2779082