【摘要】：目的:培養(yǎng)hAMSCs至第4代,模擬人類羊水胎糞液進入母體循環(huán)建立SD孕鼠羊水栓塞模型,在注入羊水胎糞液前后經(jīng)孕鼠腹腔靜脈移植hAMSCs,研究補體C3a、MPO、NF-κB在AFE中的變化,探討hAMSCs對孕鼠AFE的調(diào)節(jié)作用。方法:培養(yǎng)hAMSCs至第4代,FCM檢測其表型及IHC檢測波形蛋白表達情況,調(diào)整其濃度為1×10~5個/mL。40只健康SD孕鼠,隨機分為對照組(NS組,n=10)、羊水胎糞組(MAF組,n=10)、實驗組1(n=10)、實驗組2(n=10),其中實驗組1在建立羊水栓塞模型前30min移植hAMSCs,實驗組2在注入羊水胎糞液后隨即移植hAMSCs。取右肺組織進行HE染色,APM特染,IHC檢測CK16表達情況,驗證羊水栓塞模型是否成功。肺組織稱量濕重及干重(W/D)。IHC檢測各組右肺組織NF-κB、C3a的表達,Western-blot檢測左肺NF-κB的相對含量,分光光度法測量左肺MPO的吸光度(A),ELISA檢測血清C3a的含量。所有數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計分析,各組間進行方差齊性檢驗,方差齊采用單因素方差分析,方差不齊采用秩和檢驗,P0.05有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.hAMSCs表型鑒定:流式細胞儀檢測結(jié)果顯示hAMSCs高表達CD34、CD90、CD105、CD73、CD45,幾乎不表達CD11b、CD19和HLA-DR。2.臨床表現(xiàn):對照組未見明顯異常;MAF組注入羊水胎糞液后呼吸淺快,心率先加快后逐漸減慢,期間出現(xiàn)局部抽搐、大小便失禁;實驗組1移植hAMSCs,呼吸出現(xiàn)一過性加快,注入羊水胎糞液呼吸、心跳加快,而后呼吸變淺但頻率未見明顯改變,個別出現(xiàn)抽搐、大小便失禁;實驗組2注入羊水胎糞液和移植hAMSCs后呼吸快,心率快,個別孕鼠出現(xiàn)抽搐、大小便失禁。3.鑒定AFE模型:HE染色見MAF組、實驗組1、實驗組2肺組織不同程度充血,且肺血管內(nèi)見不定形物質(zhì)存在,APM特染肺血管內(nèi)見藍染的羊水黏液成分及桃紅色絲狀物,IHC檢測CK16顯示肺血管內(nèi)呈棕黃色絮狀或絲狀物表達。4.各組肺組織W/D:對照組(3.67±0.23)、MAF組(10.03±0.60)、實驗組1(8.43±0.20)、實驗組2(8.27±0.22),MAF組、實驗組1、實驗組2與對照組比較均有差異(P0.05),MAF組與實驗組1、實驗組2比較均有差異(P0.05)。5.C3a表達:IHC染色肺血管周圍、肺支氣管周圍及肺組織間隙見棕黃色顆粒表達,對照組強陽性表達,MAF組弱陽性表達,實驗組1、實驗組2陽性表達。各組OD值:對照組(0.36±0.02)、MAF組(0.142±0.027)、實驗組1(0.25±0.15)、實驗組2(0.27±0.02)。ELISA檢測C3a水平:對照組(27.23±1.06)、MAF組(16.47±1.13)、實驗組1(21.61±0.72)、實驗組2(22.52±0.83)。MAF組、實驗組1、實驗組2與對照組比較均有差異(P0.05),MAF組與實驗組1、實驗組2比較均有差異(P0.05)。6.NF-κB表達:IHC染色肺血管及肺支氣管周圍見棕黃色顆粒,對照組弱陽性表達,MAF組強陽性表達,實驗組1、實驗組2陽性表達。各組OD值:對照組、(0.14±0.02)MAF組(0.39±0.05)、實驗組1(0.27±0.02)、實驗組2(0.25±0.03)。Western blot檢測NF-κB:對照組(0.09±0.04)、MAF組(0.44±0.08)、實驗組1(0.15±0.03)、實驗組2(0.12±0.04)。MAF組、實驗組1、實驗組2與對照組比較均有差異(P0.05),MAF組與實驗組1、實驗組2比較均有差異(P0.05)。7.分光光度法檢測MPO活力:對照組(1.22±0.13)、MAF組(3.56±0.85)、實驗組1(2.26±0.12)、實驗組2(2.15±0.13),MAF組、實驗組1、實驗組2與對照組比較均有差異(P0.05),MAF組與實驗組1、實驗組2比較均有差異(P0.05)。結(jié)論:1.羊水栓塞發(fā)生時激活補體途徑,補體C3a在AFE發(fā)生過程中起重要作用,中性粒細胞、NF-κB在羊水栓塞急性肺損傷中發(fā)揮重要的促炎作用。2.hAMSCs對羊水栓塞發(fā)生時C3a、MPO、NF-κB有一定的調(diào)節(jié)作用,能減輕羊水栓塞引起的肺損傷。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.468
【圖文】：

圖 1-1 人羊膜間充質(zhì)干細胞生長形態(tài)圖（×100）注：圖 A 示原代人羊膜間充質(zhì)干細胞形態(tài)，呈星形、多角形、梭型；圖 B 示第四代人羊膜間充干細胞形態(tài)，呈長梭型旋渦狀或單層放射狀生長。1.5.2 IHC 檢測 hAMSCs 波形蛋白表達情況鏡下觀到第 4 代 hAMSCs 經(jīng)過 DAB 染色后呈陽性，被染成淺紅色，而對照組未被染色。見圖 1-2。

圖 1-1 人羊膜間充質(zhì)干細胞生長形態(tài)圖（×100）注：圖 A 示原代人羊膜間充質(zhì)干細胞形態(tài)，呈星形、多角形、梭型；圖 B 示第四代人羊膜間充干細胞形態(tài)，呈長梭型旋渦狀或單層放射狀生長。1.5.2 IHC 檢測 hAMSCs 波形蛋白表達情況鏡下觀到第 4 代 hAMSCs 經(jīng)過 DAB 染色后呈陽性，被染成淺紅色，而對照組未被染色。見圖 1-2。

圖 1-3 流式細胞儀檢測人羊膜間充質(zhì)干細胞表型結(jié)果1.6 羊水栓塞模型的建立1.6.1 模擬人體建立孕鼠 AFE 模型1.6.1.1 實驗分組40 只健康 SD 雌性大鼠隨機分為 4 組：對照組（NS 組）10 只，羊水胎糞組（MAF組）10 只，實驗組 1（hAMSCs+MAF 組；Experimental group 1，EG1）10 只，實驗組 2（MAF+hAMSCs 組；Experimental group 2，EG2）10 只。1.6.1.2 制備羊水胎糞液術(shù)前 12 小時禁食，通過腹腔按 0.35mL/100g 注入 10%水合氯醛進行麻醉。麻醉生效后固定孕鼠，備皮，中下腹部正中切口約 3~4cm，逐層打開腹腔，輕拉子宮行子宮次全切術(shù)，切下的子宮溫鹽水紗布覆蓋。分離腹主動脈及腹主靜脈，手術(shù)鉗夾閉手術(shù)切口，溫鹽水紗布覆蓋。切下的子宮用一手托住且輕擠羊膜腔使大量羊水集中于下端，持 20mL 注射器于羊膜腔下端抽取羊水，恒溫水浴箱暫存?zhèn)溆�。剪開羊膜腔，取

【參考文獻】

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本文編號：2753060