【摘要】：背景與目的多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性較常見一種生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病,臨床癥狀主要為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng),排卵異常,卵巢多囊樣改變,高雄激素血癥,肥胖以及胰島素抵抗,并伴有較多遠(yuǎn)期并發(fā)癥,如糖尿病,高血壓,高血脂,心血管疾病等,嚴(yán)重危害女性的身心健康。目前,關(guān)于PCOS的發(fā)病機(jī)制尚不明確,研究表明PCOS的發(fā)病與遺傳,環(huán)境,種族,生活方式以及慢性低度炎性反應(yīng)均有關(guān)系,探索PCOS可能的發(fā)病機(jī)制并尋找一種治療PCOS,延緩遠(yuǎn)期并發(fā)癥的有效方法,已經(jīng)成為目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。microRNA(miRNA)是一種短鏈非編碼RNA,可在翻譯前水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與各種生命活動(dòng),調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡,其表達(dá)水平異常可造成機(jī)體生活活動(dòng)的紊亂,導(dǎo)致癌癥,免疫性,內(nèi)分泌性等疾病的發(fā)生。研究表明,miRNA可能與胰島素抵抗的發(fā)生,卵泡發(fā)育障礙,顆粒細(xì)胞增殖凋亡以及卵泡激素的合成有關(guān),在PCOS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用。近期,外泌體已經(jīng)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn),關(guān)于外泌體的研究越來(lái)越多。外泌體是由細(xì)胞通過胞吞胞吐作用分泌的一種直徑在30-100nm的膜性小囊泡,有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),鏡下呈杯口狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含miRNA,mRNA,lncRNA,脂質(zhì),蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì),廣泛分布于血清,血漿,卵泡液,腹水,唾液,尿液等多種體液中。外泌體作為一種新興的細(xì)胞間溝通媒介,可以通過將蛋白質(zhì),miRNA,mRNA等分子物質(zhì)傳遞到靶細(xì)胞中而在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要的作用。所以,目前關(guān)于外泌體源性miRNA作用的研究已經(jīng)成為一個(gè)新的方向,探索外泌體源性miRNA在各種疾病發(fā)生發(fā)展中可能分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)將從多囊卵巢綜合征患者血清,卵泡液外泌體miRNA出發(fā),通過高通量測(cè)序以及生物信息學(xué)分析,篩選出PCOS患者差異性表達(dá)的血清外泌體源性miRNA,為PCOS的診斷以及發(fā)病機(jī)制的研究提供一定的理論基礎(chǔ);同時(shí)篩選出PCOS患者差異性表達(dá)的卵泡液外泌體源性miRNAs及卵泡液特異性外泌體miRNAs,為探索PCOS患者胚胎質(zhì)量下降、排卵異常的分子機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。材料和方法選擇于河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕的患者,根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)診斷為PCOS的患者為實(shí)驗(yàn)組,因單純輸卵管因素不孕的患者為對(duì)照組,經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書后,選擇半年內(nèi)未進(jìn)行激素治療的患者于月經(jīng)第2-4天抽取外周血,同時(shí)收取入組患者取卵當(dāng)日的外周血及第一管清亮無(wú)血液污染的卵泡液。將收取的標(biāo)本3000 rpm離心20 min,取上清液,分裝后凍于-80℃冰箱中備用。隨后,利用Exoquick ~(TM)試劑盒提取血清及卵泡液中的外泌體,透射電子顯微鏡觀測(cè)提取物的大小和形態(tài),Western-Blot檢測(cè)外泌體特異性蛋白標(biāo)志物CD63和CD9的表達(dá);采用試劑盒提取純化外泌體miRNAs,高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析PCOS組和正常組血清及卵泡液外泌體中miRNAs的差異性表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Real Time qPCR,qRT-PCR)對(duì)10種篩選出的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。采用SPSS22.0軟件錄入數(shù)據(jù)后進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的計(jì)量資料以x±s(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,P0.05為兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.經(jīng)透射電鏡和Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)于血清和卵泡液中分離出的提取物符合文獻(xiàn)中對(duì)外泌體形態(tài)及特征的描述;2.高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:月經(jīng)D2-4外周血血清外泌體樣本中,PCOS組共有243條差異表達(dá)顯著的miRNAs,其中表達(dá)上調(diào)115條,下調(diào)128條;q-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示miR-146a-5p,25-5p,27a-3p,93-5p,23a-3p,223-5p,25-3p,483-5p,383-5p的表達(dá)水平在PCOS組顯著升高(P0.05);而miR-141-3p的表達(dá)水平較正常組雖有下降,但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3.PCOS卵泡液外泌體中差異表達(dá)倍數(shù)在2倍以上且兩組均顯示“Detected”的miRNAs共有68條,表達(dá)上調(diào)27條,下調(diào)41條,篩選10條進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示10種miRNAs的表達(dá)水平在PCOS患者中均較對(duì)照組顯著升高(P0.05);4.將卵泡液測(cè)序結(jié)果與取卵當(dāng)天血樣測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)僅在卵泡液中表達(dá)的差異性表達(dá)miRNAs,共有63條,其中表達(dá)上調(diào)30條,下調(diào)33條。結(jié)論1.與NON-PCOS相比,PCOS月經(jīng)期血清中存在差異性表達(dá)miRNA,miR-146a-5p,93-5p,27a-3p,-23a,483-5p可能通過調(diào)控胰島素信號(hào)通路及顆粒細(xì)胞的增殖凋亡參與PCOS的發(fā)生發(fā)展。2.PCOS卵泡液外泌體中miR-16-5p,15b,486-5p可能與PCOS患者排卵障礙以及PCOS胰島素抵抗的形成有關(guān)。在PCOS中存在卵泡液特異性表達(dá)外泌體miRNA。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R711.75
【圖文】：

結(jié) 果清及卵泡液中外泌體的特性分析透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩組血清和卵泡液外泌體的形態(tài)及大�。▓D 1）為 30-250 nm 的圓形或橢圓形膜性囊泡，有雙層膜性結(jié)構(gòu)，可單個(gè)分群聚集分布，兩組之間形態(tài)與大小無(wú)明顯差異；SDS-PAGE 電泳后經(jīng)染色劑染色后顯示兩組電泳結(jié)果中蛋白條帶相似（圖 2），Wester行 CD9，CD63 的鑒定，檢測(cè)出兩組患者血清和卵泡液外泌體中均有63 的表達(dá)，而細(xì)胞中無(wú)這兩種蛋白（圖 3，圖 4）。

圖 2 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)血清外泌體蛋白成分 圖 3 Western blot 檢測(cè)外泌體標(biāo)志分圖 4 CD9，CD63 特異性蛋白分子在兩組卵泡液外泌體中的表達(dá)2 PCOS 血清外泌體差異性表達(dá) miRNAs 的生物信息學(xué)分析比對(duì)常見的 RNA 序列，檢測(cè)出樣品中的非編碼 small RNA，通過與已知RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定小 RNA，分析出各類小 RNA 的所占比例，其中 miRN

圖 2 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)血清外泌體蛋白成分 圖 3 Western blot 檢測(cè)外泌體標(biāo)志分圖 4 CD9，CD63 特異性蛋白分子在兩組卵泡液外泌體中的表達(dá)2 PCOS 血清外泌體差異性表達(dá) miRNAs 的生物信息學(xué)分析比對(duì)常見的 RNA 序列，檢測(cè)出樣品中的非編碼 small RNA，通過與已知RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定小 RNA，分析出各類小 RNA 的所占比例，其中 miRN

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本文編號(hào)：2752025