【摘要】：目的在女性苗勒氏管發(fā)育異常(müllerian duct anomalies,MDAs)患者中尋找EMX2基因外顯子及側(cè)翼序列可能存在的基因突變,對(duì)新發(fā)現(xiàn)基因突變進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn),期待發(fā)現(xiàn)女性苗勒氏管發(fā)育異常的原因。方法收集在我院確診為女性苗勒氏管發(fā)育異常的患者靜脈血標(biāo)本162例,正常對(duì)照組靜脈血標(biāo)本100例,再利用改良鹽析法提取外周血細(xì)胞中的DNA,使用引物設(shè)計(jì)軟件Prime 5.0設(shè)計(jì)EMX2基因外顯子及側(cè)翼序列引物,以患者提取的外周血DNA為模板,通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),分別擴(kuò)增EMX2基因3個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列,將出現(xiàn)目的條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和測序,將測序產(chǎn)生的圖形文件利用Chromas 2.31軟件讀取測序圖,按照突變測序圖要求找出新發(fā)突變。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的突變運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果在162例女性苗勒氏管發(fā)育異�；颊咄庵苎狣NA中未發(fā)現(xiàn)EMX2基因外顯子區(qū)域存在堿基突變。在一名子宮縱隔(不全性)患者EMX2基因3’非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基變異*6(TG),通過生物軟件進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該變異位點(diǎn)存在兩個(gè)微小RNA(micro RNA4307和micro RNA1258)與變異區(qū)域結(jié)合,并且其中該變異位點(diǎn)位于micro RNA4307種子結(jié)合區(qū)域。100名正常對(duì)照EMX2基因外顯子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變,3’UTR也未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。我們利用多種生物信息學(xué)預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)micro RNA4307和micro RNA1258在EMX2基因3’UTR存在多個(gè)結(jié)合區(qū)域,應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)micro RNA4307和micro RNA1258分別能與EMX2基因3’UTR結(jié)合。對(duì)含有該變異位點(diǎn)的區(qū)域利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)micro RNA4307和micro RNA1258不與EMX2基因3’UTR堿基變異*6(TG)結(jié)合。結(jié)論在EMX2基因外顯子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變,該基因可能與苗勒氏管發(fā)病不相關(guān)。女性苗勒氏管發(fā)育異常患者(不全子宮縱隔)EMX2基因3’UTR存在堿基變異*6(TG),3’UTR單個(gè)堿基變異可能不影響EMX2基因的表達(dá)。EMX2基因是micro RNA4307和micro1258調(diào)控靶基因。目的HOXA10基因EMX2基因是兩個(gè)參與苗勒氏管形成發(fā)育和胚胎著床的重要轉(zhuǎn)錄因子。HOXA10基因與EMX2基因5’端一段150 bp調(diào)控元件結(jié)合來抑制EMX2的表達(dá)。TENM基因編碼的是一組保守的Ⅱ型跨膜蛋白,EMX2調(diào)控TENM1基因的表達(dá)。本課題的研究目的是利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)的方法探討HOXA10基因EMX2基因TENM1基因在原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮內(nèi)膜的m RNA和蛋白表達(dá)情況,揭示HOXA10基因EMX2基因TENM1基因在不孕和不全子宮縱隔發(fā)生中的作用。方法首先選取在我們醫(yī)院診斷原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)患者13例,同時(shí)選取12例對(duì)照組(正常子宮),所有研究對(duì)象均通過經(jīng)陰道超聲(transvaginal ultrasound,TVS)診斷為不全子宮縱隔,排除其他原因?qū)е虏辉邪Y。從月經(jīng)周期第10天開始利用TVS檢測卵泡發(fā)育情況,待卵泡發(fā)育成熟檢測黃體生成素(luteinizing hormone,LH)峰結(jié)合TVS判斷卵巢排卵日期,在分泌中期(月經(jīng)周期的19 23天)行宮腔鏡檢查同時(shí)留取子宮側(cè)壁內(nèi)膜組織,處理后置于低溫冰箱保存。后期利用Real-time PCR和Western Blot方法,檢測原發(fā)不孕癥組(不全子宮縱隔)和對(duì)照組(正常子宮)分泌中期子宮側(cè)壁內(nèi)膜組織中HOXA10基因EMX2基因TENM1基因m RNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果在13例原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)組和12例對(duì)照組(正常子宮)分泌中期子宮側(cè)壁內(nèi)膜組織中均檢測到HOXA10,EMX2,TENM1的m RNA和蛋白表達(dá)。HOXA10基因在原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮內(nèi)膜組織的m RNA較12例對(duì)照組(正常子宮)的分泌中期子宮內(nèi)膜組織表達(dá)下降52%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),蛋白表達(dá)下降了51%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。EMX2基因在原發(fā)不孕(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮內(nèi)膜組織的m RNA和蛋白表達(dá)水平均較和12例對(duì)照組(正常子宮)的分泌中期子宮內(nèi)膜組織表達(dá)量增加,m RNA升高2.396倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),蛋白表達(dá)水平升高2.504倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。TENM1基因在原發(fā)不孕(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮內(nèi)膜組織的m RNA和蛋白表達(dá)水平均較和12例對(duì)照組(正常子宮)的分泌中期子宮內(nèi)膜組織表達(dá)量增加,m RNA升高2.270倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),蛋白表達(dá)水平升高1.597倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論HOXA10基因、EMX2基因、TENM1基因均在分泌中期子宮內(nèi)膜中表達(dá)。HOXA10基因在原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮側(cè)壁內(nèi)膜組織中m RNA和蛋白水平均低于對(duì)照組(正常子宮),提示HOXA10基因的表達(dá)降低參與不孕癥的發(fā)生,可能參與的不全子宮縱隔的發(fā)病。EMX2基因在原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮側(cè)壁內(nèi)膜組織中m RNA和蛋白水平均高于對(duì)照組(正常子宮),提示EMX2基因的表達(dá)增高參與不孕癥的發(fā)生,可能參與的不全子宮縱隔的發(fā)病。TENM1基因在原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮側(cè)壁內(nèi)膜組織中m RNA和蛋白水平均高于對(duì)照組(正常子宮),提示TENM1基因的表達(dá)增高參與不孕癥的發(fā)生,可能參與不全子宮縱隔的發(fā)病。HOXA10基因在原發(fā)不孕癥(不全子宮縱隔)患者分泌中期子宮側(cè)壁內(nèi)膜組織中m RNA和蛋白表達(dá)降低,導(dǎo)致EMX2基因表達(dá)增高,進(jìn)一步引起TENM1基因的表達(dá)增高可能是不孕癥發(fā)生和不全子宮縱隔發(fā)病的原因。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R711.1
【圖文】：

AFS女性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常分類標(biāo)準(zhǔn)

GV214和GV268質(zhì)粒載體

GV272質(zhì)粒載體

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本文編號(hào)：2751698