【摘要】：目的探究環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑塞來昔布增強卵巢癌細胞紫杉醇和順鉑化療敏感性的作用及線粒體P糖蛋白(P-gp)相關(guān)的分子機制。方法1.MTT實驗檢測塞來昔布短期(48 h)單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用對卵巢癌細胞株A2780及其紫杉醇耐藥株A2780T的生長抑制作用。2.流式細胞術(shù)檢測塞來昔布單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用(48 h)對A2780T細胞凋亡的影響;克隆形成實驗檢測塞來昔布在長期(10-14 d)低濃度(10μM)和高濃度(100μM)下單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用對A2780T細胞克隆形成的影響。3.塞來昔布(濃度梯度)處理耐藥卵巢癌細胞A2780T后,電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化;MitoTracker Deep Red標記線粒體后,激光共聚焦顯微鏡觀察多藥耐藥蛋白P-gp表達和線粒體分布的變化。4.密度梯度離心法提取耐藥卵巢癌細胞A2780T和其親本株A2780細胞線粒體,免疫印跡法(WB)檢測提取線粒體的完整性和純度,流式細胞術(shù)檢測在細胞外塞來昔布對線粒體轉(zhuǎn)運羅丹明123(Rho123)功能的影響。5.塞來昔布(濃度梯度,時間梯度)處理耐藥卵巢癌細胞A2780T后,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測多藥耐藥基因Mdr-1在轉(zhuǎn)錄水平的變化;免疫印跡法(WB)檢測P-gp蛋白在全細胞水平表達的變化;塞來昔布(濃度梯度)處理耐藥卵巢癌細胞A2780T后,提取線粒體,WB檢測P-gp蛋白在線粒體水平表達的變化。6.塞來昔布單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用處理A2780T細胞,WB檢測凋亡相關(guān)因子caspase-3,Bcl-2,Bax,PARP等蛋白水平表達變化。結(jié)果1.在藥物短期(48 h)作用時,塞來昔布單一用藥在高濃度(100μM)下抑制A2780T、A2780細胞的生長(p0.05),而低濃度(10μM)作用不明顯;同樣,在與紫杉醇或順鉑聯(lián)用時,只有高濃度(100μM)塞來昔布才會在短期內(nèi)(48 h)增強兩種化療藥對兩種卵巢癌細胞株的生長抑制作用(p0.05)。2.塞來昔布單藥短期(48 h)作用時,隨著藥物濃度增加,A2780T細胞凋亡增加。高濃度塞來昔布(100μM)與紫杉醇或順鉑聯(lián)用時,A2780T細胞凋亡增加(p0.01),但是低濃度(10μM)塞來昔布聯(lián)合用藥A2780T細胞的凋亡無顯著增加(p0.05)。然而,無論低濃度(10μM)還是高濃度(100μM)塞來昔布長期(10-14 d)作用均可使A2780T細胞的克隆形成明顯減少(p0.01,p0.001)。3.塞來昔布使A2780T細胞線粒體出現(xiàn)腫脹、嵴結(jié)構(gòu)消失等凋亡前狀態(tài)并促進線粒體向細胞核周圍聚集。4.密度梯度離心法所提取線粒體純度高,完整性好;流式細胞檢測A2780T細胞線粒體對Rho123的外排率發(fā)現(xiàn),與未處理組(64.77%)相比,塞來昔布預(yù)處理組外排率為31.6%,與P-gp特異性抑制劑環(huán)孢素A預(yù)處理后(19.71%)作用相似。5.在細胞水平,塞來昔布可顯著抑制Mdr-1基因的mRNA和蛋白質(zhì)的表達,這種抑制作用呈濃度時間非依賴性。在線粒體水平,塞來昔布抑制P-gp蛋白表達。6.塞來昔布使caspase-3激活增加,與紫杉醇聯(lián)用PARP激活顯著增加,且與順鉑聯(lián)用Bcl-2的表達顯著降低。結(jié)論塞來昔布增強耐藥卵巢癌細胞對紫杉醇和順鉑的化療敏感性,其作用可能是通過抑制線粒體表面P-gp的表達和功能導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)失衡從而啟動線粒體凋亡通路實現(xiàn)。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31
【圖文】：

MTT 法檢測其對腫瘤細胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn) 100 μM 以下濃度塞來昔布對腫瘤細胞毒性作用�。▓D 1A）。100 μM 塞來昔布作用 A2780、A2780T 細胞 48h 后，細胞生存率分別為為 0.81±0.04；0.78±0.04。對于親本卵巢癌細胞株 A2780 來說，低濃度紫杉醇 0.05μM 或順鉑 4μM 即可對其產(chǎn)生一定的殺傷作用，而與塞來昔布 100μM 聯(lián)用仍可進一步對其產(chǎn)生明顯的生長抑制作用，顯著降低腫瘤細胞的生存率（圖 1C）；而對于獲得性紫杉醇耐藥卵巢癌細胞株 A2780T，較高濃度的紫杉醇（30μM）或順鉑（15μM）對其殺傷作用仍不明顯，但是與塞來昔布（100μM）聯(lián)用后 A2780T 細胞的生長抑制作用顯著增強（圖 1B）。由于腫瘤耐藥是目前臨床化療失敗的重要因素，增加化療藥物劑量伴隨著藥物毒性的顯著增加，而安全濃度下的紫杉醇對敏感細胞已經(jīng)有顯著的殺傷作用（數(shù)據(jù)未顯示），故接下來我們的實驗主要圍繞塞來昔布對耐藥卵巢癌細胞 A2780T 的生長抑制作用及其機制進行研究。

再分別加入紫杉醇（30μM）或順鉑（15μM）組 A2780T 細胞的凋亡率顯著增加（圖2B，D）。因我們使用的塞來昔布抑制細胞生長或凋亡的有效濃度（100 μM）遠大于臨床上每天口服 400mg 所達到的血藥濃度（10 μM）�？紤]到塞來昔布在臨床上是連續(xù)給藥，而紫杉醇和順鉑等化療藥是周期間歇給藥。根據(jù)這一特點，我們采用克隆形成實驗分析分別長期（10-14d）給予低濃度（10μM）、高濃度（100μM）塞來昔布觀察其對 A2780T 細胞集落形成的影響。給藥方式如下：塞來昔布單藥組持續(xù)給予含相應(yīng)濃度塞來昔布的培養(yǎng)基；紫杉醇或順鉑單藥組分別加入加入紫杉醇（30 μM）或順鉑（15μM）處理 48h 后，更換新鮮培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)；塞來昔布聯(lián)合紫杉醇或順鉑組首先給予塞來昔布預(yù)處理 3h，再分別加入紫杉醇（30 μM）或順鉑（15μM），48h 后撤化療藥，更換為只含塞來昔布的培養(yǎng)基，10-14d 后觀察每組克隆形成情況。如圖 2E，G 所示

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