本文關鍵詞：子癇前期相關hsa-miR-18b-5p靶基因的分析驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期常見特發(fā)疾病,主要在妊娠20周以后出現高血壓、蛋白尿為主的臨床癥狀,在疾病的早期就可發(fā)生全身多器官系統(tǒng)的功能障礙,是導致孕產婦和圍生兒病死率的重要原因之一[1]。目前PE的病因和病理機制尚未闡明,沒有有效的預防和治療方法,只能對癥治療或者終止妊娠控制病情發(fā)展,該疾病是妊娠合并癥中疑難解決的問題之一[2]。但從PE的臨床轉歸來看,患者終止妊娠后各臨床癥狀迅即得以緩解,表明PE是胎盤相關性疾病[9]。近年來研究表明,子癇前期胎盤組織中存在差異性表達的微小RNA(micro RNA,mi RNA),它在基因表達調控中發(fā)揮著重要作用,PE的發(fā)生發(fā)展可能與這些差異性表達mi RNA密切相關[3-8]。我們實驗室前期研究發(fā)現mi RNA-18b在PE患者的胎盤組織中是呈病理性低表達的[10],并初步檢測了mi RNA-18b在滋養(yǎng)細胞中的功能[25],但未深入查找mi RNA-18b的靶分子。眾所周知,mi RNA是通過對其靶分子的基因沉默作用發(fā)揮生物學作用的[37],我們通過靶基因分析初步預測了mi R-18b的靶基因為低氧誘導因子1α(HIF-1α),Karamjit等人在對高原牦牛的HIF-1α基因克隆研究中也提到HIF-1α被預測是人類mi R-18b的靶基因[11],但未通過實驗證實。有研究表明HIF-1α在子癇前期的胎盤組織中是過表達的[12],這與mi RNA對其相關靶基因特有的基因沉默調控趨勢是相符的,由此我們推測mi R-18b可能通過調控其靶基因HIF-1α的表達從而參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗擬深入研究兩者的靶向關系,以便為子癇前期的預防和治療提供新的方向。目的1.應用生物信息學方法并結合相關文獻初步預測PE相關的mi R-18b-5p的靶基因為HIF-1α,同時在人絨毛膜滋養(yǎng)細胞層細胞(HTR-8/SVneo)模型中驗證HIF-1α的表達。2.通過熒光素酶報告載體實驗進一步驗證mi R-18b-5p與其靶基因HIF-1α的基因調控作用,揭示mi R-18b-5p在PE發(fā)生過程中的病理作用。方法1.應用靶基因預測軟件Target Scan、mi RBase等六種方法初步驗證mi R-18b-5p與靶基因HIF-1α的靶向調控關系。2.采用逆轉錄-聚合酶鏈反應技術(Reverse transcriptase polymerase chain reaction RT-PCR)檢測HTR-8/SVneo細胞系中HIF-1α的表達情況。3.應用mi RNA的過表達與抑制技術,在HTR-8/SVneo細胞中過表達與抑制mi R-18b-5p后,采用實時熒光定量PCR技術(quantificational real-time polymerase chain reaction real-time PCR)和免疫印跡(Western-blot)技術分別在m RNA水平和蛋白水平驗證mi R-18b-5p與HIF-1α的靶向調控關系。4.采用熒光素酶報告基因法,對PE相關的mi R-18b-5p與其靶基因HIF-1α進行靶點驗證,進一步明確mi R-18b-5p與HIF-1α的負性靶向調控關系。結果1.通過Target Scan等六種靶基因軟件預測技術并取其中四種方法的交集,結果表明mi R-18b-5p與HIF-1α存在靶向調控。2.RT-PCR技術結果表明HTR-8/SVneo細胞系中有HIF-1α的表達。3.在HTR-8/SVneo細胞中過表達與抑制mi R-18b-5p后,real-time PCR結果顯示轉染mi R-18b-5p mimics的HTR-8細胞中mi R-18b-5p的表達量與對照組相比顯著上升,與對照組相比,轉染mimics后的細胞中HIF-1αm RNA表達水平顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);轉染mi R-18b-5p inhibitor的HTR-8細胞中mi R-18b-5p的表達量與對照組相比顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),轉染inhibitor后的細胞中HIF-1αm RNA表達水平與對照組相比上升不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western-blot結果顯示在細胞中過表達mi R-18b-5p后HIF-1α在蛋白水平是顯著降低的,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);在細胞中降調節(jié)mi R-18b-5p后HIF-1α在蛋白水平是增高不顯著,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明mi R-18b-5p與HIF-1α存在負性調控關系。4.雙熒光素酶報告基因法結果顯示:野生型HIF-1α與mi R-18b-5p mimics共轉染組的熒光素酶活性與對照組相比下降了25%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);突變型HIF-1α與mi R-18b-5p mimics共轉染組與對照組比較差異不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論1.通過靶基因預測軟件分析結果顯示:mi R-18b-5p與HIF-1α之間存在靶向調控位點并通過實驗驗證人絨毛膜滋養(yǎng)細胞層細胞(HTR-8/SVneo)中有HIF-1α的基礎表達,這為在HTR-8/SVneo細胞中研究mi R-18b-5p與HIF-1α的靶向關系提供了細胞模型研究的基礎。2.載體實驗驗證結果顯示,mi R-18b-5p與HIF-1α在m RNA水平和蛋白水平均存在負性靶向調控作用。在VEGF信號通路中,mi R-18b-5p可能通過調控靶基因HIF-1ɑ參與了PE發(fā)生的基因調控過程,這為闡明PE的病理機制奠定了一定的理論和實驗基礎。
【關鍵詞】：子癇前期 微小RNA 胎盤 低氧誘導因子1α
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-21
• 1 微小RNA的研究進展13-16
• 2 子癇前期16-18
• 3 miRNA與PE相關性的發(fā)現18-19
• 4 HIF-1α與PE相關性的研究進展19-21
• 實驗一 hsa-miR-18b-5p靶基因的預測、篩選和低氧誘導因子HIF-1α在人絨毛膜滋養(yǎng)細胞系HTR-8／SVneo中的表達21-35
• 1 材料21-28
• 2 方法28-31
• 3 結果31-33
• 4 討論33-35
• 實驗二 hsa-miR-18b-5p靶基因的驗證35-64
• 1 材料35-36
• 2 方法36-51
• 3 結果51-62
• 4 討論62-64
• 小結64-65
• 參考文獻65-74
• 個人簡歷和研究成果74-75
• 致謝75-76

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1 桑翠琴;張震宇;王淑珍;劉浩;郭淑麗;;重度子癇前期/子癇合并急性呼吸窘迫綜合征的診斷與處理[J];中國醫(yī)刊;2006年10期

2 趙桂花;;重度子癇前期與子癇82例臨床分析[J];臨床醫(yī)藥實踐雜志;2007年01期

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6 朱倩;;對38例子癇前期(重)、子癇治愈的體會[J];實用預防醫(yī)學;2007年05期

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本文編號：273688