【摘要】：研究背景2008年至今的調(diào)查研究顯示,子宮內(nèi)膜癌每年的新發(fā)病例數(shù)占所有女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤患者的第一位,并且己經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了宮頸癌的發(fā)病率。而在美國以及歐洲的一些國家,子宮內(nèi)膜癌己成為女性群體發(fā)病頻率最高的生殖系統(tǒng)好發(fā)的惡性腫瘤,四分之三以上的患者集中在絕經(jīng)期婦女,屬于女性的三大生殖系統(tǒng)癌癥之一。根據(jù)美國的癌癥協(xié)會2018年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,子宮內(nèi)膜癌的新發(fā)病患者大約在63230人,而其中的11350名婦女將因該病死亡。近年來,隨著子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例數(shù)的迅速增加,針對子宮內(nèi)膜癌的篩查、診斷標(biāo)準(zhǔn)以及外科治療手段已得到廣泛應(yīng)用。但至今仍沒有精準(zhǔn)的途徑對子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行預(yù)后評估,因此,迫切需要找到一種可評估子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的生物標(biāo)志物,開展靶向治療。STEAP1是STEAP蛋白家族的重要成員之一,主要定位在質(zhì)膜上,一般存在與細(xì)胞和細(xì)胞相互連接的地方。STEAP1參與細(xì)胞間通訊,且具有金屬還原酶活性,可能與分泌和內(nèi)吞作用的膜轉(zhuǎn)運功能、細(xì)胞凋亡和存活有關(guān)。STEAP蛋白家族已被證明在前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均存在表達(dá)。STEAP1被認(rèn)為是重要的診斷指標(biāo)和有效治療靶點,所以,STEAP1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病以及轉(zhuǎn)歸中具體的作用機(jī)制值得深入研究。研究目的1.驗證STEAP1在正常子宮內(nèi)膜以及癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義;2.證經(jīng)慢病毒調(diào)控STEAP1的表達(dá)后,子宮內(nèi)膜癌侵襲性和轉(zhuǎn)移強度發(fā)生的改變;3.探索子宮內(nèi)膜癌的EMT進(jìn)展中STEAP1的潛在影響機(jī)制。研究方法1.利用免疫組織化學(xué)實驗(IHC)比較STEAPI在正常子宮內(nèi)膜以及癌組織內(nèi)的表達(dá)差異;2.利用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合鏈反應(yīng)實驗(RT-qPCR)和免疫印跡實驗(Western blotting)從mRNA和蛋白水平檢測STEAP1在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞以及癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異;3.慢病毒介導(dǎo)的外源性強制增強或抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE和Ishikawa中STEAP1的表達(dá),并用RT-qPCR和Western blotting從mRNA和蛋白質(zhì)水平驗證轉(zhuǎn)染效率,檢測調(diào)控前后STEAP1的表達(dá)差異;4.免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC,細(xì)胞爬片實驗)檢測STEAP1在外源性強制增強和抑制表達(dá)的不同侵襲能力的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的表達(dá);5.以Boyden小室為依托,進(jìn)行Transwell侵襲和轉(zhuǎn)移實驗,檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系侵襲和遷移能力因慢病毒調(diào)控STEAP1的表達(dá)而呈現(xiàn)的差異,明確STEAP1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲遷徙中的作用機(jī)制;6.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期以及進(jìn)行細(xì)胞平板克隆實驗,檢測轉(zhuǎn)染前后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長和增殖能力,明確STEAP1在其中發(fā)揮的作用;7.建立裸鼠體內(nèi)移植瘤模型,制備外源性強制高表達(dá)的STEAP1和沉默STEAP1的細(xì)胞懸液,于裸鼠頸背松軟的皮膚下分別接種轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,定期觀察腫瘤生長速度和體積大小,并記錄,自接種日起喂養(yǎng)56天后脫臼處死,并將腫瘤完好的于本體剝離;8.利用RT-qPCR和Western blotting檢測調(diào)控STEAP1后,細(xì)胞和動物體內(nèi)移植瘤EMT特征標(biāo)志物基因的表達(dá);9.明膠酶譜實驗檢測轉(zhuǎn)染前后基質(zhì)蛋白金屬酶MMP2和MMP9的表達(dá)情況。研究結(jié)果1.子宮內(nèi)膜癌組織的STEAP1著色強度相對比正常組織明顯偏低,STEAP1著色強度與癌組織的分化、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的發(fā)生有顯著的相關(guān)性聯(lián)系(P0.05);2.子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的STEAP1表達(dá)程度比正常細(xì)胞內(nèi)STEAP1明顯偏低(P0.05),且隨子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的分化和運動能力增強而減弱,提示STEAP1參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲;3.在共聚焦高內(nèi)涵顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光數(shù)大于85%,RT-qPCR和Western blotting實驗結(jié)果支持鏡下的結(jié)果;4.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果證實,沉默STEAP1后,癌細(xì)胞Ishikawa-shRNA中STEAP1表達(dá)降低,過表達(dá)STEAP1建立后,癌細(xì)胞KLE-exSTEAPl中STEAP1的表達(dá)增強;5.子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲移動過程以及增殖和克隆形成能力受到慢病毒調(diào)控STEAP1表達(dá)降低得以促進(jìn),相反的,因慢病毒調(diào)控STEAP1過表達(dá)受到明顯抑制;6.體內(nèi)實驗表示,接種STEAP1降表達(dá)高侵襲轉(zhuǎn)移性細(xì)胞組,腫瘤體積較大,結(jié)節(jié)較多；接種STEAP1過表達(dá)低侵襲轉(zhuǎn)移性細(xì)胞組,動物形成的移植瘤體積較小、表面光滑,生長速度明顯比降表達(dá)組慢;7.RT-qPCR、Western blotting和明膠酶譜實驗顯示,shRNA干擾STEAP1降表達(dá)后,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa-shRNA中E-cadherin表達(dá)減弱,而Ishikawa-shRNA中的N-cadherin、Vimentin和 Snail、Slug表達(dá)強度上升,而且 Ishikawa-shRNA中的Twist、MMP2和MMP9也呈現(xiàn)表達(dá)升高的趨勢,促進(jìn)了 EMT進(jìn)程;相反的,在過表達(dá)STEAP1后,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE-exSTEAP1的E-cadherin呈現(xiàn)升高表達(dá),而 KLE-exSTEAPl 中的 Snail、Slug和N-cadherin、Vimentin均呈現(xiàn)出低表達(dá)趨勢,而且KLE-exSTEAP1中的Twist、MMP2和MMP9也呈現(xiàn)表達(dá)減弱的趨勢,阻礙了 EMT歷程。研究結(jié)論1.STEAP1在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)并且與惡性臨床表型、不良預(yù)后有關(guān);2.STEAP1可以作為治療靶點抑制子宮內(nèi)膜癌的增殖、侵襲性和轉(zhuǎn)移能力;3.STEAP1表達(dá)上調(diào)可抑制子宮內(nèi)膜癌中EMT進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33
【圖文】：

圖１邋ＳＴＥＡＰ１在子宮內(nèi)膜組織內(nèi)的表達(dá)逡逑注．？邋ａ，ｂ分別是正常子宮內(nèi)膜處于增值和分泌期；ｃ是高分化的Ｉ期癌組織；ｄ逡逑是高分化的ＩＩ期癌組織；ｅ是低分化的ＩＩＩ期癌組織；ｆ是低分化的ＩＶ期癌組織。逡逑＞＜２００。逡逑２４逡逑

本次分析共包括２４８例子宮內(nèi)膜癌患者，ＳＴＥＡＰ１低表達(dá)患者包括２１１逡逑例，ＳＴＥＡＰ１高表達(dá)患者３７例，結(jié)果顯示，ＳＴＥＡＰ１高表達(dá)組患者的生存時間逡逑比ＳＴＥＡＰ１低表達(dá)組的患者更長，且更能夠獲得良好預(yù)后，見圖２邋（Ｐ＜０．０５）。逡逑２５逡逑

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本文編號：2719633