【摘要】：目的:子宮內膜異位癥(Endometriosis,EMS,內異癥)在婦科領域是一種依賴于雌激素的慢性常見病,自身細胞功能障礙可能是該病病因。其典型的臨床表現(xiàn)為盆腔腫塊和痛經,可引起慢性盆腔疼痛,不孕等疾病,并具有廣泛植入和惡性腫瘤侵襲性生長能力等生物學行為。關于EMS的文獻提示在位內膜自身的分子生物學特性與正常子宮內膜有很大區(qū)別,例如遷徙、侵襲、增殖、凋亡和血管生成能力等,這些現(xiàn)象可能是基因水平的表達差異引起的,而且在子宮內膜處于分泌期時,相應生物學功能更強。最近的研究發(fā)現(xiàn),在位內膜的細胞周期相關基因的異常表達同樣會引起內異癥。本課題組前期通過對內異癥在位內膜和正常子宮內膜的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA、lncRNA)芯片篩查結合生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)其中AC002454.1基因是差異表達的基因之一。AC002454.1是一種天然反義lncRNA。反義lncRNA起作用的經典模式是與相鄰基因的mRNA形成RNA-RNA二聚體,改善相鄰基因的mRNA的穩(wěn)定性,從而上調相鄰基因的表達。根據(jù)與正義鏈編碼基因重疊方向和長度,又將反義lncRNA的作用形式分為頭對頭、尾對尾和完全重疊。在芯片分析中,AC002454.1與其相鄰的周期蛋白依賴性激酶-6(Cyclin-dependent kinase 6,CDK6)基因相關,兩者均位于7號染色體,有長約139個核苷酸的重疊區(qū)。AC002454.1與CDK6以頭對頭重疊的形式存在,即反義鏈5’端序列與正義鏈的5’端序列互補。并且已經通過實時熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction、qRT-PCR)實驗驗證,內異癥患者在位內膜中AC002454.1 mRNA相對表達量明顯增高并且與CDK6 mRNA正相關。CDK6是細胞周期調節(jié)中發(fā)揮重要作用的蛋白激酶,在細胞G1期中結合CyclinD1,磷酸化下游pRb,釋放結合的轉錄因子E2F,使細胞周期的進程得以啟動,同時啟動細胞增殖相關基因的轉錄。芯片分析中CDK6是在pathway分析排在首位的細胞周期通路中差異倍數(shù)最高的mRNA,GO分析也提示差異mRNA轉錄本主要與細胞周期有關。CDK6除了作為激酶的活性功能外,可以增強血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)表達水平,促進血管生成及內皮細胞生長。CDK6的作用機制與內異癥形成過程相吻合,即在位內膜細胞隨經血逆流后進入盆腔后需黏附在異位部位、進而通過血管生成,細胞侵襲等過程,種植于異位部位。因此得出推測:CDK6功能異�？梢鹱訉m內膜細胞細胞周期紊亂,逃逸免疫清除,細胞生物學特性增強,而AC002454.1在內異癥中的作用可能通過對CDK6的調節(jié)來實現(xiàn),共同參與內異癥的發(fā)病過程。本研究擬利用組織實驗、體外細胞實驗探討AC002454.1和CDK6在內異癥發(fā)病中的作用及機制,為內異癥的發(fā)病機制研究提供理論基礎。研究方法:采用qRT-PCR檢測內異癥在位內膜組織和異位內膜組織及正常子宮內膜組織中AC002454.1和CDK6 mRNA的表達情況并進行相關性分析。利用蛋白免疫印跡方法(Western blot)和免疫組化方法檢測正常子宮內膜組織,內異癥在位內膜組織和異位內膜組織中CDK6蛋白的表達情況。借助于原代細胞培養(yǎng)技術、qRT-PCR、Western blot技術對內異癥患者在位內膜間質細胞和正常子宮內膜間質細胞中AC002454.1和CDK6的表達量進行檢測。分別下調內異癥患者在位內膜間質細胞中AC002454.1和CDK6表達量,分別上調正常子宮內膜間質細胞中AC002454.1和CDK6表達量,qRT-PCR和Western blot檢測慢病毒轉染前后AC002454.1和CDK6 mRNA和蛋白表達水平的改變,以及細胞周期相關蛋白pRb、cyclinD1、E2F的改變。CCK-8細胞增殖實驗檢測AC002454.1和CDK6表達變化的前后細胞增殖能力的改變。劃痕實驗對AC002454.1和CDK6表達變化前后細胞遷移能力進行檢測,Transwell細胞侵襲實驗對AC002454.1和CDK6表達變化前后細胞侵襲能力進行檢測,流式細胞技術對AC002454.1和CDK6表達變化前后細胞周期分布進行檢測。利用RNA純化染色質分離實驗和蛋白質譜分析檢測與AC002454.1特異性相互作用的蛋白。利用qRT-PCR對AC002454.1特異性相互作用的蛋白在內異癥在位內膜間質細胞中的mRNA表達水平進行驗證,并分析與AC002454.1和CDK6表達的相關性。結果:1、qRT-PCR結果提示:AC002454.1和CDK6 mRNA相對表達量在內異癥患者異位及在位內膜組織中明顯高于正常內膜組織(P0.05),而異位內膜組織和在位內膜組織之間表達量沒有顯著差異(P0.05)。在位內膜組織與正常內膜組織中AC002454.1和CDK6 mRNA相對表達量呈正相關(Pearson相關系數(shù)為:0.691,P0.001)。Western blot結果提示:內異癥患者在位內膜組織中CDK6蛋白相對表達量明顯高于正常內膜組織(P0.05),而異位內膜組織和在位內膜組織之間表達差異不顯著(P0.05)。免疫組化結果提示:CDK6蛋白主要表達在子宮內膜間質細胞的細胞質及細胞核中。CDK6蛋白在正常內膜組織中表達的陽性率為15.0%,在內異癥患者在位和異位內膜組織中CDK6蛋白陽性率為82.0%和68%,以上結果提示,CDK6蛋白在內異癥在位內膜組織中表達陽性率明顯高于正常子宮內膜組織(P0.05),而內異癥異位內膜組織和在位內膜組織之間表達無顯著差異(P0.05)。2、體外細胞實驗中,qRT-PCR提示:與每組相對應的空白對照組和陰性對照組結果相比,內異癥在位內膜間質細胞下調AC002454.1表達量后AC002454.1表達明顯降低(P0.05),上調AC002454.1毒的正常子宮內膜間質細胞中AC002454.1表達明顯升高(P0.05),下調CDK6表達后,內異癥在位內膜間質細胞中CDK6表達水平明顯降低(P0.05),上調CDK6表達后,正常子宮內膜間質細胞中CDK6表達水平明顯升高(P0.05),說明轉染成功。沉默AC002454.1組內異癥在位內膜間質細胞中CDK6 mRNA表達量下降(P0.05),過表達AC002454.1組正常子宮內膜間質細胞中CDK6 mRNA表達量增高(P0.05)。Western blot結果提示:AC002454.1下調組內異癥在位內膜間質細胞中CDK6蛋白表達量下降(P0.01),pRb、cyclinD1、E2F蛋白表達量下降(P0.05)。AC002454.1上調組正常子宮內膜間質細胞中CDK6蛋白表達量增高(P0.05),pRb、cyclinD1、E2F蛋白表達量上升(P0.05)。CCK8實驗檢測結果提示:內異癥在位內膜間質細胞在沉默AC002454.1后增殖能力明顯降低(P0.05),沉默CDK6后增殖能力明顯降低(P0.05),正常內膜間質細胞在上調AC002454.1后增殖能力顯著增高(P0.05),過表達CDK6后增殖能力明顯增高(P0.05)。劃痕實驗檢測結果提示:內異癥在位內膜間質細胞在下調AC002454.1后遷移能力明顯降低(P0.01),沉默CDK6后遷移能力明顯降低(P0.01),正常內膜間質細胞在上調AC002454.1后遷移能力增高(P0.01),過表達CDK6后遷移能力明顯增高(P0.01)。Transwell侵襲實驗結果提示:內異癥在位內膜間質細胞沉默AC002454.1后侵襲能力明顯降低(P0.01),沉默CDK6后侵襲能力明顯降低(P0.01),正常子宮內膜間質細胞過表達AC002454.1后侵襲能力明顯增高(P0.01),過表達CDK6后侵襲能力明顯增高(P0.01)。流式細胞技術檢測結果提示:內異癥在位內膜間質細胞沉默AC002454.1后細胞G0/G1期比例明顯增加,S期比例明顯減少(P0.01),沉默CDK6后細胞G0/G1期比例明顯增加,S期比例明顯減少(P0.01),正常子宮內膜間質細胞過表達AC002454.1后細胞G0/G1期比例明顯減少,S期比例明顯增加(P0.01),過表達CDK6后細胞G0/G1期比例明顯減少,S期比例明顯增加(P0.01)。3、RNA純化染色質分離技術聯(lián)合蛋白質譜分析檢測結果提示:與AC002454.1特異性相互作用的蛋白共有37個。STRING數(shù)據(jù)庫分析提示:其中熱休克蛋白90AB1(heat shock protein 90 k Da alpha,class B member 1,HSP90AB1)和CDK6存在蛋白相互作用關系,預測分數(shù)為0.472,在其他物種中相互作用分數(shù)為0.668。HitPredict數(shù)據(jù)庫提示二者相互作用分數(shù)為0.665。qRT-PCR提示:HSP90AB1 mRNA在內異癥在位內膜間質細胞中表達高于正常子宮內膜間質細胞(P0.05),并且HSP90AB1 mRNA表達量與AC002454.1、CDK6 mRNA表達量呈正相關(Pearson相關系數(shù)分別為0.980和0.895、P0.01)。結論:1、AC002454.1和CDK6在內異癥在位內膜中均高表達,并呈正相關,兩者均有促進在位內膜間質細胞增殖、遷移、侵襲的能力。AC002454.1和CDK6可能通過影響在位內膜細胞生物學特性參與內異癥的疾病發(fā)展。2、在在位內膜間質細胞中調節(jié)AC002454.1的表達后,CDK6 mRNA及蛋白表達相應發(fā)生變化,細胞周期相關蛋白pRb、cyclinD1、E2F隨之變化,細胞G0/G1期和S期比例發(fā)生改變。AC002454.1調節(jié)CDK6的表達可能是內異癥在位內膜細胞周期紊亂等分子生物學異常的分子機制。3、AC002454.1特異性相互作用的蛋白HSP90AB1,與CDK6蛋白之間也存在蛋白互作關系并且在內異癥在位內膜細胞中表達相關。說明AC002454.1可能通過HSP90AB1作為橋梁,進而影響CDK6蛋白,從而對內異癥產生作用,即HSP90AB1可能是CDK6的下游靶基因之一,有待進一步驗證。
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中國醫(yī)科大學博士學位論文3 結果3.1 子宮內膜異位癥患者異位及在位內膜組織中 AC002454.1 和CDK6 mRNA 表達情況qRT-PCR 檢測子宮內膜組織中 AC002454.1 和 CDK6 mRNA 表達情況。結果見圖 1.1A，GAPDH 作為內參，內異癥在位內膜組織中 AC002454.1 和 CDK6mRNA 表達高于正常內膜組織（P<0.05），而內異癥患者異位內膜組織和在位內膜組織之間表達差異并不顯著（P > 0.05）。對 AC002454.1 和 CDK6 mRNA 在內異癥在位內膜組織與正常內膜組織中的表達量進行相關性分析，結果見圖1.1B，AC002454.1 和 CDK6 mRNA 相對表達量呈正相關（Pearson 相關系數(shù)為：0.691，P<0.001）。

圖 1.2 子宮內膜組織 CDK6 蛋白表達圖中 A 為子宮內膜組織中 CDK6 蛋白電泳圖；B 為 CDK6 蛋白在子宮內膜組織相對表達量。NE：正常子宮內膜組織，EU：內異癥在位內膜組織，EC：異位內膜組織。3.2.2 免疫組化檢測情況免疫組化結果提示：CDK6 蛋白主要表達在間質細胞的細胞質及細胞核中（圖 1.3）。正常內膜組織中 CDK6 蛋白表達的陽性率為 25.0%，內異癥在位內膜組織和異位內膜組織 CDK6 蛋白陽性率分別為 73.0%和 66.7%。該結果表明，，內異癥患者在位內膜中 CDK6 蛋白的陽性表達率明顯高于正常子宮內膜（P<0.05），而異位內膜和在位內膜之間無顯著差異（P > 0.05）（表 1.2）。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R711.71

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本文編號：2711035