【摘要】：【目的】AZD1775促進有絲分裂并通過強制細胞連續(xù)的進入復制周期來增加基因組的不穩(wěn)定性,最終導致有絲分裂災難引起細胞凋亡。然而,目前尚未有AZD1775對免疫微環(huán)境的影響的研究。本研究主要目的為闡釋AZD1775上調卵巢癌細胞PD-L1的機制及其聯(lián)合αPD-L1治療卵巢癌的潛在價值�！痉椒ā緾CK8檢測了AZD1775對一系列卵巢癌細胞的毒性作用。流式檢測了AZD1775對細胞周期的影響。免疫熒光,彗星實驗和克隆形成實驗用于檢測AZD1775對腫瘤細胞的DNA損傷作用。通過實時定量熒光PCR技術(q PCR)及蛋白印跡實驗(Western Blot,WB)檢測AZD1775處理后ID8細胞,OV2008細胞和C13細胞PD-L1表達變化。AZD1775處理后ID8細胞的RNAseq數據用于機制探究。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測AZD1775處理后ID8細胞,OV2008細胞和C13細胞干擾素表達變化,q PCR及WB檢測DNMT1及干擾素信號通路活化相關基因改變,免疫熒光檢測ds RNA表達改變來驗證AZD1775上調PD-L1表達的機制。ID8移植瘤模型用以評估AZD1775聯(lián)合αPD-L1治療卵巢癌的效果。流式細胞術檢測小鼠腫瘤組織內免疫細胞成分變化。The Cancer Genome Atlas(TCGA)數據庫用于驗證基于病毒防御反應相關基因構建的signature對免疫檢查點治療反應預測的準確性【結果】我們證實了AZD1775在卵巢癌細胞中的周期調控和DNA損傷作用。同時,我們發(fā)現(xiàn)AZD1775能夠明顯上調卵巢癌細胞PD-L1的表達。RNAseq數據的GSEA分析發(fā)現(xiàn),AZD1775處理后干擾素信號通路明顯富集。AZD1775處理后各型干擾素均有一定程度的分泌,其中變化最顯著的是三型干擾素。AZD1775通過ds RNA導致干擾素分泌升高。同時,我們也發(fā)現(xiàn)AZD1775能夠下調DNMT1的表達介導了內源性逆轉錄病毒(ERVs)基因的表觀調控,進而影響了其轉錄產物ds RNA的表達。AZD1775下調E2F通路使DNMT1表達下降。動物體內實驗發(fā)現(xiàn)AZD1775與αPD-L1聯(lián)合治療的效果好于單獨使用AZD1775。此外,流式檢測腫瘤組織內免疫細胞成分,發(fā)現(xiàn)AZD1775處理后腫瘤組織內T淋巴細胞比例增加,主要為CD8+T細胞,Treg細胞比例下降,CD8+/Treg比例明顯增加。我們利用TCGA數據庫RNAseq數據對WEE1基因同CD3e,CD4,CD8a,CD68,DNMT1,STAT1作相關性分析。我們發(fā)現(xiàn)WEE1表達同CD3e,CD8a,CD68表達呈負相關,與DNMT1的表達呈正相關。我們基于病毒防御反應基因構建的Signature與TCGA數據庫中的卵巢癌數據進行對比,發(fā)現(xiàn)該Signature與卵巢癌“免疫反應型”的結果非常吻合�！窘Y論】我們的研究闡釋了AZD1775上調卵巢癌細胞PD-L1表達的機制,描述了其聯(lián)合應用αPD-L1的治療效果。不但補充了AZD1775在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用,更重要的是有助于探索更精準的小分子靶向治療聯(lián)合免疫治療的治療模式,為改善卵巢癌預后開辟一個新的方向。
【圖文】：

25 1.AZD1775 在 9 株卵巢癌細胞系中的 IC50。9 株卵巢癌細胞系（C13，OV2008，ID8，Cao90，，OVCAR3，SKOV3，TOV-21G，ES2），給予不同濃度梯度的 AZD1775 處理 48 小時，CC測存活細胞比例，計算每種細胞系的 IC50。為了檢測 AZD1775 對卵巢癌細胞的殺傷效果，我們選取了 9 株卵巢癌細胞C13，OV2008，ID8，Caov3，OV90，OVCAR3，SKOV3，TOV-21G，ES2），給同濃度梯度的 AZD1775 處理 48 小時，CCK8 檢測存活細胞比例（圖 1）。我們發(fā)

C13（IC50 =3 23.8nM），OV2008（IC50 = 458.7nM），OVCAR3（IC50 = 590.6nM），SKOV3（IC50 = 770.4nM），TOV-21G（IC50 = 346.1nM），ES-2（IC50 = 285.3nM）對 AZD1775 相對敏感，而 ID8（IC50 = 14.295μM），Caov3（IC50 = 1.911μM），OV90（IC50 = 2.463μM）相對耐藥。我們選取了兩株人源性卵巢癌細胞系 C13，OV2008和一株鼠源性卵巢癌細胞系 ID8 作為后續(xù)研究細胞株。DNA 損傷時，WEE1 可在 G2/M 期檢測點阻斷細胞有絲分裂，進行 DNA 損傷修復。AZD1775 通過與 WEE1 結合而抑制性的磷酸化 CDK1（CDC2），進而腫瘤細胞損傷 DNA 累積，導致染色體丟失，細胞凋亡，稱為“有絲分裂災難”。C13，OV2008和 ID8 三株卵巢癌細胞系用 AZD1775（800nM）處理 24 小時后，流式檢測細胞系周期變化。我們發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，AZD1775 處理組破壞了 G2/M 期的檢查點阻滯，導致細胞過早進入 M 期，G2/M 期比例升高。AZD1775 處理 24 小時后，C13 G2/M 期細胞比例由 17.8%升高到 25.8%，OV2008 G2/M 期細胞比例由 18.8%升高到 26.8%，ID8 G2/M 期細胞比例則由 9.75%升高到 17.7%（圖 2）。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

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