發(fā)布時間：2020-05-05 16:08

【摘要】：研究背景和目的:滋養(yǎng)細胞功能異常是引起子癇前期的重要因素,目前滋養(yǎng)細胞功能的調控機制尚未完全闡明。滋養(yǎng)細胞因持續(xù)缺氧所導致的過度凋亡可影響胎盤形成過程,進而誘發(fā)包括子癇前期(Preeclampsia,PE)在內的多種妊娠相關疾病。野生型p53誘導磷酸酶(Wild-type p53-induced phosphatase,Wip1)可通過p38和p53途徑正向調控腫瘤細胞生存,但其在滋養(yǎng)細胞中的表達方式及調控作用目前尚無報道。本課題將探討Wip1通過p53依賴途徑調控滋養(yǎng)細胞凋亡具體機制,以期為子癇前期發(fā)病機制提供新的研究方向。方法:WB和RT-qPCR分別檢測正常與PE胎盤組織中Wip1蛋白和mRNA水平;免疫組化和免疫熒光分別檢測胎盤組織和HTR8/SVneo細胞中Wip1的表達定位;運用物理和化學方法構建兩種滋養(yǎng)細胞體外缺氧模型,并使用Wip1特異性抑制劑GSK2830371和慢病毒包被短發(fā)夾RNA(shRNA)分別抑制Wip1酶活性和表達后,通過流式細胞術檢測細胞凋亡水平變化,同時WB檢測cleaved-caspase 9等凋亡相關分子以進一步驗證。單獨或聯(lián)合運用p38、Mdm2和蛋白酶體特異性抑制劑處理細胞模型以檢測反饋通路中各信號分子的相互作用;通過免疫共沉淀檢測Wip1對Mdm2-p53互作的調控作用;最后,WB驗證胎盤組織中各信號分子的表達情況。結果:Wip1在PE胎盤和PE細胞模型中均顯著上調,藥物抑制Wip1活性和慢病毒敲降Wip1后均可部分逆轉缺氧所誘導的p38磷酸化、cleaved-caspase 9和細胞凋亡水平,同時促進p53在Ser15位點的磷酸化,并抑制Mdm2-p53結合。Mdm2降解受到抑制后可導致p53失穩(wěn)態(tài),并抑制p38-Wip1反饋途徑;Mdm2-p53互作減少可使p53累積并激活p38-Wip1反饋途徑。參與調控滋養(yǎng)細胞p38-Wip1反饋通路的調節(jié)因素中,Mdm2-p53的互作過程比Mdm2的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著更為重要的作用。結論:缺氧應激狀態(tài)下,滋養(yǎng)細胞通過p38-Wip1反饋途徑來維持p53穩(wěn)態(tài),當該反饋途徑發(fā)生紊亂時可引起滋養(yǎng)細胞過度凋亡,進而誘發(fā)PE發(fā)生。
【圖文】：

24圖 1 Wip1 在 PE 胎盤和缺氧細胞模型中表達異常Fig. 1. Expression pattern of Wip1 is altered in PE placentas and trophoblastic PE modelsA. 對正常孕婦的絨毛（a-c）、晚期胎盤（d-f）和蛻膜組織（g-h）進行 CK7、CD31、HLA-G和 Wip1 染色來檢測 Wip1 在內皮細胞、細胞滋養(yǎng)細胞、合體滋養(yǎng)細胞、絨毛外滋養(yǎng)細胞和絨毛柱中的表達定位情況。比例尺=200μm；B. 正常胎盤和 PE 胎盤中 Wip1 mRNA 相對表達水平，，n=7，*p＜0.05，采用 student’s-t 檢驗進行統(tǒng)計分析；C. 正常胎盤和 PE 胎盤組織中 Wip1蛋白相對表達水平，n=7，***p＜0.001，采用 student’s-t 檢驗進行統(tǒng)計分析；D. 對 24 小時缺氧、常氧處理后的 HTR8/SVneo 細胞進行免疫熒光染色，比較不同處理下 Wip1（綠色熒光）相對表達水平，DAPI（藍色熒光）用于染細胞核。比例尺=100μm；E-F. 免疫印跡檢測 24 小時缺氧處理后 AMPKα、ACC 磷酸化水平及 Wip1 表達水平的變化。n=4，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，采用 student’s-t 檢驗進行統(tǒng)計分析。所有實驗均重復三次。

ncluded as control. Nuclei were counterstained by DAPI (blue). Scale bar, 100μ m; Ehosphorylation levels of AMPKα and ACC, and Wip1 protein expression in HTR8/SVneo cfter 24 h of HII (E) and SIB (F) treatments were examined by Western blotting. n=4, *P<0*P<0.01, ***P<0.001, Student’s t-test. Experiments were performed in triplicate..4 抑制 Wip1 可降低 HTR8/SVneo 細胞因缺氧所致的凋亡水平為探究Wip1在滋養(yǎng)細胞中調控作用是否與腫瘤細胞一致——負性調控凋亡，本課題組首先通過慢病毒轉染的方法構建 Wip1 敲降細胞株，并結合使用 W異性抑制劑 GSK2830371，然后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平的變化。結示慢病毒轉染效率可達 90%以上，敲降效率為 51.16%（圖 2A-B）；HII 和 S種缺氧條件均可明顯上調 HTR8/SVneo 細胞凋亡水平，而慢病毒轉染SK2830371 處理后可明顯降低細胞因缺氧引起的凋亡水平（圖 3A-C）。這些結明，Wip1 在滋養(yǎng)細胞中調控凋亡的方式與腫瘤細胞并不相同，呈現(xiàn)為正向調現(xiàn)象。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714.244

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