【摘要】：目的:本研究主要在前期工作的基礎(chǔ)上,檢測TMEFF1在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá);構(gòu)建TMEFF1穩(wěn)定過表達(dá)及抑制表達(dá)的細(xì)胞系,探討TMEFF1對卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,探索TMEFF1下游激活的通路,尋找調(diào)控TMEFF1的轉(zhuǎn)錄因子及相互作用的蛋白,為研究卵巢癌的早期診斷、療效判斷、術(shù)后隨訪以及生物治療等提供新的思路和途徑。研究方法:1.利用Real-time PCR、Western blot檢測了TMEFF1在卵巢癌細(xì)胞系及正常卵巢細(xì)胞中的表達(dá)。利用過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建TMEFF1過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3-TMEFF1-H和ES-2-TMEFF1-H及其對照細(xì)胞系OVCAR3-TMEFF1-HMock和ES-2-TMEFF1-H-Mock。通過慢病毒shRNA獲得的穩(wěn)定抑制表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系CAOV3-TMEFF1-L、SKOV3-TMEFF1-L及其對照細(xì)胞系CAOV3-TMEFF1-L-Mock和SKOV3-TMEFF1-L-Mock。通過Real-time PCR、Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測TMEFF1轉(zhuǎn)染前后卵巢癌細(xì)胞系TMEFF1的表達(dá)變化。通過MTT實驗檢測差異表達(dá)TMEFF1基因前后卵巢癌細(xì)胞增殖能力的變化,劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力變化,Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力變化,流式細(xì)胞實驗檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化。2.利用Western blot方法檢測TMEFF1基因差異表達(dá)前后,MAPK信號通路節(jié)點蛋白RAF、p-RAF、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK的表達(dá)變化,PI3K/AKT信號通路節(jié)點蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表達(dá)變化,及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9的表達(dá)變化。進(jìn)一步應(yīng)用MTT實驗、劃痕實驗、Transwell實驗及流式細(xì)胞術(shù)檢測添加通路抑制劑(PD98059,GDC0941)前后過表達(dá)TMEFF1的卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的變化,細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變。3.利用生信網(wǎng)站預(yù)測TMEFF1上游的轉(zhuǎn)錄因子,通過ChIP實驗檢測轉(zhuǎn)錄因子p53與TMEFF1基因啟動子區(qū)域直接結(jié)合情況。通過siRNA瞬時轉(zhuǎn)染構(gòu)建差異表達(dá)TP53的卵巢癌細(xì)胞系。通過Western blot方法檢測差異表達(dá)TP53后,TMEFF1的表達(dá)變化情況。通過蛋白質(zhì)譜檢測卵巢癌細(xì)胞系中與TMEFF1互相作用的蛋白,利用免疫共沉淀及免疫熒光共聚焦方法進(jìn)行驗證。結(jié)果:1.卵巢癌細(xì)胞系CAOV3、SKOV3中TMEFF1 mRNA及蛋白表達(dá)高于細(xì)胞系ES-2及OVCAR3,而正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC表達(dá)最低。過表達(dá)TMEFF1后,卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的細(xì)胞增殖能力提高,遷移和侵襲能力提高,細(xì)胞凋亡減少,細(xì)胞G0/G1期縮短,S期及G2/M期延長。而干擾卵巢癌細(xì)胞系CAOV3中TMEFF1表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力降低,遷移和侵襲能力降低,細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞G0/G1期延長,S期及G2/M期縮短。2.過表達(dá)TMEFF1后發(fā)現(xiàn)MAPK通路中RAF、MEK和ERK的磷酸化比例升高,PI3K/AKT通路中PI3K、AKT的磷酸化比例升高,與EMT相關(guān)的N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9蛋白也均升高,E-cadherin蛋白降低。干擾TMEFF1表達(dá)后,RAF、MEK和ERK的磷酸化比例下降,PI3K/AKT通路中PI3K、AKT的磷酸化比例下降,N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9蛋白也均下降,E-cadherin蛋白升高。加入MAPK或PI3K通路抑制劑后,過表達(dá)TMEFF1的卵巢癌細(xì)胞系增殖能力、遷移能力和侵襲能力均下降,而細(xì)胞凋亡明顯增加。3.轉(zhuǎn)錄因子p53可以直接結(jié)合在TMEFF1啟動子區(qū)域。干擾TP53基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)TMEFF1的表達(dá)明顯下降。蛋白質(zhì)譜找到TMEFF1的互作蛋白AHNAK,免疫共沉淀驗證了二者在卵巢癌細(xì)胞中的相互作用,免疫熒光驗證了二者在卵巢癌組織及細(xì)胞中共定位。結(jié)論:1.卵巢癌中TMEFF1的高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,抑制了細(xì)胞凋亡。2.TMEFF1參與促進(jìn)EMT的發(fā)生,并激活了MAPK通路及PI3K/AKT通路從而促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡。3.卵巢癌中TMEFF1受到上游轉(zhuǎn)錄因子p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,且TMEFF1與蛋白AHNAK相互作用。
【圖文】：

圖 1 Western blot 檢測 TMEFF1 在卵巢癌細(xì)胞系及正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異圖 2 RT-PCR 檢測 TMEFF1 mRNA 在卵巢癌細(xì)胞系及正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異3.2 建立 TMEFF1 穩(wěn)定表達(dá)卵巢癌細(xì)胞系模型利用 TMEFF1 高表達(dá)的 CAOV3 及 SKOV3 卵巢癌細(xì)胞建立 TMEFF1 基因抑

CR 檢測 TMEFF1 mRNA 在卵巢癌細(xì)胞系及正常卵MEFF1 穩(wěn)定表達(dá)卵巢癌細(xì)胞系模型MEFF1 高表達(dá)的 CAOV3 及 SKOV3 卵巢癌細(xì)胞系模型，，利用 TMEFF1 低表達(dá)的 OVCAR3因穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系模型。通過 Real-time PC示過表達(dá)組細(xì)胞 TMEFF1 基因及蛋白表達(dá)水平組細(xì)胞 TMEFF1 基因及蛋白表達(dá)水平比對照組免疫細(xì)胞化學(xué)實驗結(jié)果同上述實驗結(jié)果一致（
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

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本文編號：2638427