【摘要】：研究背景壓力性尿失禁(Stress Urinary Incontinence,SUI)是好發(fā)于孕產(chǎn)婦及中、老年婦女的慢性病,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,被稱(chēng)為“社交癌”。近年來(lái),隨著二胎政策開(kāi)放和人口老齡化,SUI患者數(shù)劇增,引起醫(yī)學(xué)界重視;但該病發(fā)病機(jī)制欠清,缺乏理想的臨床防治措施。現(xiàn)已公認(rèn),SUI主要由尿道支撐組織薄弱所致;進(jìn)一步研究認(rèn)為,成纖維細(xì)胞主導(dǎo)的尿道支撐組織微環(huán)境細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular Matrix,ECM)重構(gòu)障礙是該病發(fā)病的關(guān)鍵,但其具體調(diào)控機(jī)理尚未明確。外泌體是近年來(lái)備受關(guān)注的胞間通訊方式,參與多種組織局灶ECM微環(huán)境結(jié)構(gòu)及功能調(diào)控;通過(guò)探討外泌體在尿道支撐組織中的表達(dá)及其在SUI發(fā)病中的作用,有望為該病發(fā)病機(jī)制研究提供可行方向;然而,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。目的本研究旨在明確尿道支撐組織局灶微環(huán)境中是否存在外泌體調(diào)控方式;闡明SUI患者是否存在尿道支撐組織外泌體異常表達(dá);并在體外細(xì)胞水平,探討該外泌體對(duì)尿道支撐組織成纖維細(xì)胞功能的影響。研究方法1.收集女性尿道支撐組織,分為SUI組和非SUI組,每組各8例;匹配兩組間年齡、絕經(jīng)時(shí)間、孕產(chǎn)次、分娩方式及體重指數(shù)(Body Mass Index,BMI)。2.采用沉淀法提取尿道支撐組織來(lái)源外泌體,聯(lián)合電鏡、納米顆粒示蹤分析技術(shù)及蛋白免疫印跡法,鑒定其形態(tài)特征、粒徑分布范圍及外泌體標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)。3.采用納米顆粒示蹤分析技術(shù)及BCA蛋白定量法,檢測(cè)SUI組和非SUI組尿道支撐組織來(lái)源外泌體含量,比較組間差異。4.獲得女性尿道支撐組織原代成纖維細(xì)胞,共培養(yǎng)細(xì)胞與尿道支撐組織來(lái)源外泌體,分為F+Sexo組(成纖維細(xì)胞與SUI組尿道支撐組織來(lái)源外泌體共培養(yǎng))、F+Nexo組(成纖維細(xì)胞與非SUI組尿道支撐組織來(lái)源外泌體共培養(yǎng))和F組(即對(duì)照組,成纖維細(xì)胞與培養(yǎng)基共培養(yǎng)),采用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、蛋白免疫印跡法及反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)法,觀察各組成纖維細(xì)胞增殖、遷移和膠原合成功能,比較組間差異。研究結(jié)果1.女性尿道支撐組織中提取到沉淀物質(zhì),透射電鏡顯示其形態(tài)為類(lèi)圓形杯口狀,蛋白免疫印跡法顯示其外泌體特異性標(biāo)志蛋白CD63表達(dá)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,納米顆粒示蹤分析技術(shù)顯示其直徑主要分布于50-200nm區(qū)間,鑒定為外泌體。2.SUI組和非SUI組單位質(zhì)量(g)尿道支撐組織來(lái)源外泌體蛋白含量分別為1606.02 ug 和 1216.75 ug,外泌體數(shù)量分別為 2219x10^8 個(gè)和 982 x10^8 個(gè),SUI組外泌體蛋白含量和數(shù)量均顯著高于非SUI組(p均0.05)。3.F+Sexo組成纖維細(xì)胞在24h、48h及72h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖率分別為30%、52%及 214%,F+Nexo 組分別為 16%、32%及 105%;F+Sexo 組和 F+Nexo 組各時(shí)段細(xì)胞OD值均較對(duì)照組顯著增加(p均0.05),F+Sexo組各時(shí)段細(xì)胞OD值顯著高于 F+Nexo 組(p均0.05)。4.24h、48h及72h的細(xì)胞劃痕愈合率F+Sexo組分別為19%、26%及27%,F+Nexo組分別為38%、61%及77%,對(duì)照組分別為59%、100%及100%;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,F+Sexo組和F+Nexo組各時(shí)段細(xì)胞劃痕愈合率均顯著低于對(duì)照組(p均0.05),F+Sexo組各時(shí)段細(xì)胞劃痕愈合率均顯著低于F+Nexo組(p均0.05)。5.F+Sexo組細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(p均0.05);F+Nexo組細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的mRNA和蛋白水平與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1.尿道支撐組織局灶微環(huán)境存在外泌體調(diào)控方式。2.SUI組尿道支撐組織外泌體的表達(dá)量顯著高于非SUI組。3.尿道支撐組織來(lái)源外泌體可能通過(guò)影響成纖維細(xì)胞增殖、遷移及膠原合成能力參與SUI發(fā)病。
【圖文】：

３．２尿道支撐組織來(lái)源外泌體的提取及鑒定逡逑采用ＳＢ１沉淀技術(shù)從原代尿道支撐組織中成功提取沉淀物，透射電鏡觀察顯示逡逑沉淀物形態(tài)為類(lèi)圓形杯口狀（圖１Ａ），Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法顯示沉淀物外泌體特異性標(biāo)逡逑志蛋白ＣＤ６３呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)（圖１Ｂ），納米顆粒示蹤技術(shù)顯示沉淀物直徑主要分逡逑布于５０－２００ｎｍ間（圖１Ｃ－Ｅ）。以上三種方法結(jié)合，證實(shí)女性尿道支撐組織中存逡逑在外泌體分布。逡逑２１逡逑

學(xué)碩士學(xué)位論文質(zhì)量（ｇ）尿道支撐組織外泌體總蛋白量均值為１６０６．０２邋ｕｇ，非ＳＵＩｇ）尿道支撐組織外泌體總蛋白量均值為１２１６．７５邋ｕｇ；經(jīng)Ｔ檢驗(yàn)，兩計(jì)學(xué)意義，ＳＵＩ組尿道支撐組織來(lái)源外泌體蛋白含量顯著高于非．０５，，圖邋２Ｄ）。逡逑Ａ邐Ｃ逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R711.59

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本文編號(hào)：2634475