【摘要】：紫杉醇(paclitaxe,PTX)聯(lián)合鉑類藥物為卵巢癌的一線化療方案。化療誘導的腫瘤細胞信號通路激活與耐藥相關(guān)。對化療的敏感性與晚期卵巢癌患者生存期密切相關(guān)。因此,降低耐藥發(fā)生,提高化療敏感性對卵巢癌的治療十分重要。MicroRNAs是一類約含22個堿基的內(nèi)源性非編碼小RNA,參與許多信號通路分子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控�；熍c基因治療的聯(lián)合將為卵巢癌的治療開拓新的途徑。研究目的本課題旨在通過納米載藥系統(tǒng),聯(lián)合PTX及microRNA-7(miR-7),減輕化療毒副作用,提高化療的敏感性。研究內(nèi)容1.構(gòu)建共載PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒(P/MNPs)并表征。2.探討P/MNPs在卵巢癌細胞中的攝取、轉(zhuǎn)染效率及療效,并探索miR-7增敏PTX的機制。3.探討P/MNPs在小鼠卵巢癌模型中的生物分布、療效及轉(zhuǎn)染效率,并驗證miR-7增敏PTX的機制。研究方法采用復乳法制備共載PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒(P/MNPs),用正交實驗探索優(yōu)化制備條件及PTX比例。通過瓊脂糖凝膠電泳探索miR-7的適宜比例。利用粒度儀對納米粒的粒徑及電位進行測定,透射電鏡觀察納米粒形態(tài)。高效液相色譜分析測定PTX濃度,熒光分光光度計測定miR-7濃度。采用離心法分離檢測PTX包封率,透析法模擬PTX釋放,采用超濾離心法分離檢測miR-7包封率及釋放。采用CCK-8法測定納米粒毒性及IC_(50)值,通過熒光顯微鏡觀察細胞對納米粒的攝取,應用溶酶體染料觀察納米粒的溶酶體逃逸,qRT-PCR檢測miR-7的轉(zhuǎn)染效率,流式細胞儀檢測細胞的凋亡比例。采用Western blot方法檢測經(jīng)PTX處理后卵巢癌細胞的耐藥蛋白及重要信號通路的蛋白表達變化,并探索miR-7增加PTX敏感性的作用機制。構(gòu)建裸鼠卵巢癌皮下異種移植瘤模型,小動物活體成像儀觀察納米粒的生物學分布,冰凍切片檢測瘤體內(nèi)納米粒分布。應用小鼠卵巢癌皮下瘤模型研究P/MNPs的療效,監(jiān)測腫瘤大小及體重變化,收集小鼠全血及血清進行血常規(guī)及肝腎功能檢查,采用HE染色對小鼠心肝脾肺腎臟器進行病理形態(tài)觀察。通過TUNEL實驗檢測腫瘤內(nèi)的細胞凋亡比例,qRT-PCR檢腫瘤內(nèi)miR-7的表達水平,采用免疫組化法檢測腫瘤EGFR蛋白表達變化。研究結(jié)果經(jīng)正交實驗優(yōu)化P/MNPs的制作工藝后,納米粒粒徑為105.0±0.86 nm,分散系數(shù)(Polydispersity index,PDI)為0.276±0.007,Zeta電位為19.0±2.04 mV,紫杉醇的包封率為84.1±1.31%,miR-7的包封率為98.3±0.21%。納米粒形態(tài)呈圓形,分散較好,在血清中對RNA有保護作用。P/MNPs中PTX及miR-7具有緩釋特性,前24h內(nèi)以PTX釋放為主,24h以后miR-7開始加速釋放,兩種藥物的釋放存在一定的時間差,持續(xù)釋放72h以上�？蛰dmPEG-PLGA-PLL納米粒無明顯細胞毒性。納米粒相比游離藥物能更好的被細胞攝取,并呈時間依賴性。納米粒被攝取后能夠從溶酶體中逃逸發(fā)揮作用。納米粒轉(zhuǎn)染細胞24及48h后,能夠?qū)⒓毎麅?nèi)miR-7水平分別提高15倍及40倍以上。P/MNPs的IC_(50)相比游離藥物明顯降低,48h的IC_(50)為2.85±0.45 ng/mL,72h的IC_(50)為0.41±0.03 ng/mL。P/MNPs誘導腫瘤細胞凋亡的能力明顯增強,48h及72h細胞的凋亡比例分別為45.4±1.17%及72.7±2.99%。Western blot結(jié)果顯示PTX可能引起卵巢癌細胞EGFR、ERK、p-ERK蛋白的表達增加,miR-7可抑制EGFR、ERK、p-ERK蛋白表達。動物活體成像的結(jié)果提示游離藥物難以靶向腫瘤部位,P/MNPs能夠在2-8h內(nèi)聚集于腫瘤部位,并于24h達到高峰。瘤體冰凍切片顯示納米粒能夠成功的將兩種藥物同時運載至腫瘤部位。體內(nèi)療效實驗顯示P/MNPs組皮下瘤體平均重量為82.3±10.1 mg,相同用藥濃度下療效最好。毒性實驗結(jié)果提示P/MNPs組小鼠的白細胞、中性粒細胞數(shù)量相比游離藥物組有恢復,且肝功能中ALT及AST也有所下降。P/MNPs組小鼠心肝脾肺腎臟器HE染色未見明顯病理改變。小鼠腫瘤TUNEL實驗結(jié)果提示,P/MNPs組平均凋亡比例為10.7±1.87%,與游離藥物組及單藥納米粒組差異均具有統(tǒng)計學意義。瘤體qRT-PCR結(jié)果顯示,P/MNPs組的miR-7表達平均增加了21.2±6.76倍,與游離藥物組比較差異具有統(tǒng)計學意義。瘤體免疫組化的結(jié)果提示,游離PTX組的EGFR蛋白表達明顯增加,P/MNPs組的EGFR蛋白表達明顯減少,表明miR-7能抑制EGFR的表達。結(jié)論成功制備的共載PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米載藥遞送系統(tǒng)(P/MNPs)粒徑適宜,分散均勻,能保護RNA不被降解,易于被細胞攝取,緩慢釋放,高效將miR-7轉(zhuǎn)入細胞,抑制由于PTX而被激活的與耐藥相關(guān)的EGFR/ERK通路,增加腫瘤細胞對PTX的敏感性。P/MNPs在體內(nèi)實驗中能通過EPR效應靶向腫瘤部位,增加腫瘤miR-7表達,抑制EGFR表達,促進腫瘤細胞凋亡,增強化療藥物抑瘤效果,并且無明顯的毒副作用,在卵巢癌治療中具有潛在的應用價值。
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上海交通大學醫(yī)學院博士學位論文5圖1 共載紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米載藥遞送系統(tǒng)作用機制示意圖Figure1 A schematic diagram explaining the mechanism of mPEG-PLGA-PLL nanoparticles co-delivered with paclitaxel and microRNA-7本課題的研究內(nèi)容主要包括以下三個部分：第一部分，，構(gòu)建共載紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒。探究紫杉醇、miR-7與材料mPEG-PLGA-PLL的適當比例，優(yōu)化納米粒制作工藝。對納米粒進行粒徑大小、電荷、形態(tài)的表征，對藥物的釋放進行評估。第二部分，將成功構(gòu)建的共載紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒作用于卵巢癌細胞。檢測空載納米粒的細胞毒性、卵巢癌細胞對納米粒的攝取、納米粒的轉(zhuǎn)染效率以及對紫杉醇的增敏效果。探索紫杉醇作用于卵巢癌細胞后細胞通路的改變，探究miR-7增加PTX敏感性的機制。第三部分，在第二部分的研究基礎(chǔ)上進行小鼠體內(nèi)實驗。利用小鼠卵巢癌皮下瘤模型檢測mPEG-PLGA-PLL納米粒的體內(nèi)靶向性。利用小鼠卵巢癌皮下瘤模型再次驗證共載納米粒的療效并同時檢測納米粒的體內(nèi)毒性，并對納米粒的轉(zhuǎn)染效率進行體內(nèi)驗證

[36]。圖2 共載紫杉醇及miRNA的mPEG-PLGA-PLL納米粒示意圖Figure 2 Schematic illustration of mPEG-PLGA-PLL nanoparticles co-delivered withpaclitaxel and microRNA所以本研究使用mPEG-PLGA-PLL共同包載紫杉醇和miR-7，采用多種方法對其進行表征以期達到合適粒徑、形態(tài)、包封率，驗證納米粒對RNA的保護作用，評價藥物釋放，為后續(xù)實驗奠定堅實基礎(chǔ)（圖2）。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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1 吳小華;陳亞楠;楊波;周楠;王娜;許鵬宇;;細胞自噬與卵巢癌SKOV3細胞及其耐藥株SKOV3/DDP對順鉑敏感性的關(guān)系[J];腫瘤;2013年10期

本文編號：2625044