【摘要】：背景與目的線粒體是細胞中最豐富的細胞器,參與細胞能量產生、細胞信號傳導、鈣離子內環(huán)境平衡、細胞凋亡等各種關鍵性的細胞活動,在卵母細胞的成熟、受精以及早期胚胎的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)可以獨立進行復制、轉錄和翻譯,可從親代到子代穩(wěn)定遺傳。卵母細胞和精子中均含有一定數量的線粒體DNA。卵母細胞與精子相遇并受精,很短的一段時間后精子中的線粒體即被降解。因此,胚胎中的線粒體及線粒體DNA幾乎全部來自于卵母細胞。研究表明非整倍體胚胎的線粒體DNA水平比整倍體高,且線粒體DNA拷貝數與母體生育年齡和胚胎非整倍性均相關聯(lián),線粒體DNA拷貝數可作為臨床上預測植入前囊胚染色體是否異常的標志。目前已經提出,在胚胎發(fā)育的最初階段會出現(xiàn)線粒體增殖,來適應胚胎發(fā)育的起始和代謝的變化。因此,異�；蚍N植潛力較差胚胎的線粒體DNA水平增加或提前復制增殖可能是一個識別胚胎應激和發(fā)育異常的標志,這種現(xiàn)象是線粒體應對不良外界環(huán)境做出的代償性反應。但是,有研究組運用線粒體DNA標準化測量方法后,發(fā)現(xiàn)線粒體DNA與年齡、倍性及植入潛能并無較深入的關系,其預測價值有所降低。本實驗的目的在于,研究染色體倍性及胚胎質量與胚胎線粒體DNA拷貝數之間的關系,以探究染色體倍性異常的囊胚線粒體DNA是否有提前復制增殖的現(xiàn)象,評估線粒體DNA拷貝數可否作為判斷囊胚質量的指標。材料和方法分別用孤雌激活技術構建單倍體胚胎、顯微胞漿內精子注射技術構建三倍體胚胎、細胞融合技術制作四倍體胚胎,同時運用相應技術構建二倍體胚胎作為對照組;藥物(STZ)誘導法構建糖尿病小鼠模型、體外延時培養(yǎng)以獲得老化卵子,正常健康小鼠來源的卵子為對照組,與相同來源及密度的精子混合進行體外受精與胚胎培養(yǎng)。對上述各模型所得囊胚應用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(Real Time qPCR)中絕對定量PCR的方法檢測線粒體DNA拷貝數。每組數據均重復三次以上。實驗數據中計量資料以x±s(均數±標準差)表示,兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用方差分析;計數資料以百分數表示,采用卡方檢驗;P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1對孤雌激活(單倍體組)、ICSI操作(三倍體組)及受精(四倍體組)后96 h及120 h形成的囊胚收樣,簡稱96 h囊胚和120 h囊胚。兩種非二倍體囊胚線粒體DNA拷貝數與分別相應二倍體囊胚對照組相比并無顯著統(tǒng)計學差異(96h囊胚:單倍體:P=0.4291,三倍體:P=0.6001,四倍體:P=0.5325;120 h囊胚:單倍體:P=0.3005,三倍體:P=0.6073,四倍體:P=0.9767)。2無論是單倍體、二倍體、三倍體還是四倍體,96 h囊胚與120 h囊胚線粒體DNA拷貝數均無明顯差異(單倍體:P=0.7791;三倍體:P=0.8456;四倍體:P=0.7113)。3大部分單倍體、三倍體的發(fā)育速度均比對照組二倍體發(fā)育速度慢。4隨著染色體倍性的增加,同時期囊胚的細胞數逐漸減少(單倍體∶二倍體=60.09±2.61∶48.88±2.37;三倍體∶二倍體=29.00±2.46∶42.43±3.04;四倍體∶二倍體=21.77±1.52∶44.46±1.90),而且細胞體積逐漸增大。5對于質量較差的糖尿病小鼠囊胚,其線粒體DNA拷貝數是明顯增加的,有統(tǒng)計學差異(P=0.0062)。體外老化卵子來源的囊胚,其線粒體DNA數量也顯著高于正常(P=0.0092)。結論1線粒體DNA拷貝數與胚胎染色體倍性無必然聯(lián)系。2質量較差的胚胎線粒體DNA拷貝數升高,因此線粒體DNA拷貝數可能作為判斷胚胎質量的參考指標。
【圖文】：

所得不同倍性的囊胚中隨機選取部分進行了染色體鋪片和染色。經過秋水仙素同步化的囊胚細胞（包括內細胞團和滋養(yǎng)層細胞）大多處于有絲分裂中期，因此染色體可以以較明顯的形態(tài)展現(xiàn)。如圖1.1所示，分別顯示了單倍體（圖1.1A）、二倍體（圖 1.1 B）、三倍體（圖 1.1 C）和四倍體（圖 1.1 D）囊胚中一個細胞所有染色體的狀態(tài)。經鑒定，，染色體條數均符合。圖 1.1 囊胚倍性的鑒定。（A）單倍體；（B）二倍體；（C）三倍體；（D）四倍體。

圖 1.2 囊胚發(fā)育速度與染色體倍性關系A 拷貝數與囊胚染色體倍性的關系激活單倍體及二倍體囊胚、卵胞漿內精子注射三倍體及二胎電融合所成四倍體囊胚及其相應對照組二倍體胚胎，分別
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

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本文編號：2624133