【摘要】：妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖耐量受損,包含了部分妊娠前已患有糖尿病但孕期首次被診斷的患者。GDM是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一,患病率在1-20%之間,并在全球范圍內(nèi)逐漸上升。GDM不止會提高妊娠高血壓、先兆子癇等的發(fā)病率,還會提高新生兒患高膽紅素血癥,低鈣血癥,紅斑和呼吸窘迫綜合征的發(fā)病風險。已有的研究表明,GDM是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同導致的多因素疾病,但目前關(guān)于GDM的發(fā)病機制仍不十分明確。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度為18-23個核苷酸的,進化過程中高度保守的,負向調(diào)控作用的單鏈小分子非編碼RNA。其在糖尿病中發(fā)揮了重要作用,但其在妊娠糖尿病中的作用尚不清楚。為了研究miRNA在GDM中的作用,我們篩選了在GDM胎盤中差異表達的miRNAs,并對差異表達miR-21進行了功能和作用機制的研究。在本研究中,我們依據(jù)IADPSG2010診斷方法和標準糖耐量(OGTT)采集了 137例GDM患者和158例健康孕婦胎盤樣本,選取2對年齡和孕周完全匹配的胎盤標本進行miRNA芯片篩查,兩兩交差比對獲得四組數(shù)據(jù),選擇至少三組以上數(shù)據(jù)趨勢一致的miRNAs歸入差異表達miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)miR-21在GDM胎盤表達下調(diào),我們組前期的結(jié)果顯示miR-21在胚胎植入中表達上調(diào),胚胎植入時滋養(yǎng)層發(fā)揮了重要作用,而高糖會影響滋養(yǎng)層細胞的發(fā)育,那么,miR-21表達下調(diào)是否會影響胎盤的功能,進而參與GDM的發(fā)生尚不清楚。我們在大規(guī)模的GDM患者和GDM大鼠胎盤中檢測了 miR-21的表達模式,qRT-PCR結(jié)果顯示miR-21在不同年齡段GDM患者胎盤中均表達下調(diào),組織芯片原位雜交檢測顯示,miRNA-21定位于胎盤滋養(yǎng)層細胞。miR-21在GDM大鼠胎盤中表達也顯著下調(diào),這些結(jié)果顯示miR-21低表達可能有利于妊娠糖尿病的發(fā)生。為了研究miR-21妊娠糖尿病中的作用,我們以人絨毛滋養(yǎng)層細胞(HTR-8)為研究對象,利用棕櫚酸和胰島素聯(lián)合處理建立胰島素抵抗細胞模型,探討miR-21在胰島素抵抗過程中的作用。通過檢測葡萄糖吸收量和細胞總糖量發(fā)現(xiàn),正常情況下,miR-21過表達促進葡萄糖吸收,增加細胞內(nèi)的總糖量;胰島素處理可以顯著抑制miR-21過表達誘導的葡萄糖吸收增加,但在胰島素抵抗情況下,miR-21過表達對葡萄糖吸收沒有顯著影響。在正常和胰島素處理情況下,miR-21敲低對葡萄糖吸收沒有明顯影響,但胰島素抵抗情況下,miR-21敲低可以顯著促進葡萄糖吸收。根據(jù)這些研究結(jié)果我們推測,在GDM發(fā)生時,存在兩種可能情況:一是胎盤滋養(yǎng)層細胞未發(fā)生胰島素抵抗,miR-21低表達對葡萄吸收沒有明顯影響;二是胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)生胰島素抵抗,miR-21低表達打破胰島素抵抗的發(fā)生。無論哪種推測均提示miR-21可能不是通過調(diào)節(jié)葡萄糖吸收影響GDM的發(fā)生。為了進一步探索miR-21可能的作用,我們利用EdU、MTT、雙染流式法和Transwell小室結(jié)合細胞成像計數(shù)等方法分析了 miR-21對細胞增殖、凋亡、遷移和浸潤等的影響。結(jié)果顯示miR-21過表達可以促進細胞增殖、遷移和浸潤,抑制細胞凋亡;miR-21敲低可以抑制細胞增殖、遷移和浸潤,促進細胞凋亡。為研究miR-21發(fā)揮作用的可能機制,我們研究了其靶基因。生物信息學分析顯示PPARA為miR-21的靶基因,并利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和定點突變,在細胞中驗證PPARA是miR-21的靶基因之一,Western blot檢測顯示過表達miR-21抑制內(nèi)源性PPARA的表達,敲低miR-21可以促進內(nèi)源性PPARA的表達。PPARA過表達可以抑制細胞增殖、遷移和浸潤,促進細胞凋亡;敲低PPARA可以促進細胞增殖、遷移和浸潤,抑制細胞凋亡。為了進一步驗證miR-21通過PPARA發(fā)揮功能,我們利用靶基因補償實驗分析了 miR-21異常表達所引起的功能變化是否可以通過調(diào)控其靶基因PPARA得以恢復。研究發(fā)現(xiàn)PPARA過表達可以抑制miR-21過表達引起的細胞增殖、遷移和浸潤能力增強及細胞凋亡能力減弱,而miR-21低表達引起的細胞增殖、遷移和浸潤能力減弱及細胞凋亡能力增強可以被PPARA敲低所拮抗。同時,我們利用Western blot和免疫組化檢測了 PPARA在妊娠糖尿病患者胎盤中的表達,發(fā)現(xiàn)PPARA定位于胎盤滋養(yǎng)層細胞,并且在26-30歲和36歲以上孕婦胎盤組織中明顯上調(diào),其與miR-21表達下調(diào)的趨勢相一致。綜上所述,妊娠GDM患者胎盤miR-21表達下調(diào),通過上調(diào)PPARA抑制細胞生長和浸潤,進而影響胎盤功能。本研究不僅有助于從miRNAs角度揭示妊娠糖尿病中miR-21對胎盤細胞的作用及作用機理,此研究有助于為妊娠糖尿病的診斷或治療提供有價值的分子標志物。
【圖文】：

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