【摘要】：研究背景： 宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤,僅次于乳腺癌,位于婦女惡性腫瘤的第二位,90年代初,WHO宣布人乳頭瘤病毒(human papilloma viruses, HPV)是引起宮頸癌變的首要因素,因此,宮頸液基細胞學和HPV病毒聯(lián)合檢測技術(shù)明顯提高了宮頸癌篩查的準確率,尤其是對早期宮頸病變的發(fā)現(xiàn)有很大的幫助,同時也發(fā)現(xiàn)宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變患者的年齡趨于年輕化,對生育和性生活質(zhì)量的要求較高,傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、放化療等對生殖器官功能的保留不太理想,光動力療法可能成為一種新的能保留生育功能的治療方法。另外,對于年齡較大的晚期宮頸癌患者,一般情況差難以耐受化療及放療的不良反應(yīng)時,光動力治療也成為可選擇的治療方式之一。 光動力療法(PDT)是基于病變細胞選擇性的吸收光敏劑并在特定波長激光的激發(fā)下產(chǎn)生的光化學反應(yīng),對病變細胞或者組織產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。PDT現(xiàn)廣泛應(yīng)用于皮膚科、呼吸、消化、婦科等臨床科室,成為近年研究的熱點,但在發(fā)現(xiàn)PDT治療作用的同時,也發(fā)現(xiàn)其副反應(yīng)有時是嚴重的,如皮膚發(fā)生紅斑、水泡等光敏性皮炎、皮膚潰瘍等。 我們本次實驗選用的光敏劑是四甲基吡啶卟啉(5,10,15,20-tetra-(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin, TMPyP4),屬于卟啉衍生物,是一種新型的水溶性光敏劑,可以結(jié)合并穩(wěn)定人類端粒G-四鏈體的形成,抑制端粒酶的功能,而目前研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤增殖失控的關(guān)鍵在于端粒酶的激活,因此,TMPyP4通過穩(wěn)定G-四鏈體的結(jié)構(gòu),從而降低端粒酶活性,將其作用于腫瘤細胞可導致腫瘤細胞生長停止,誘導腫瘤細胞的凋亡。但近年有研究發(fā)現(xiàn),端粒酶活性在一些正常細胞中也被檢測到,如外周血、骨髓細胞和皮膚的基底層等組織。因此,卟啉類光敏劑和端粒酶的相互作用可能會影響機體的正常細胞,在正常組織產(chǎn)生副作用。另外,TMPyP4本身是一種光敏劑,在適當波長的激光照射下可發(fā)生光敏反應(yīng),對腫瘤細胞起到殺傷作用,因此從理論基礎(chǔ)上分析,TMPyP4是一種對惡性腫瘤細胞殺傷作用比較強的藥物,但它有腫瘤選擇特異性較差的缺點,在發(fā)揮治療作用的同時也可能發(fā)生相關(guān)的光敏副反應(yīng),如皮膚潰瘍、臟器損傷等,因此為了避免全身副反應(yīng)的發(fā)生,我們選擇在腫瘤局部用藥方案。 Survivin和Caspase-3是參與調(diào)節(jié)細胞凋亡的兩個重要分子,Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。有研究發(fā)現(xiàn),Survivin可能通過某種機制間接抑(?)Caspase-3的活性而抑制細胞凋亡,而Caspase-3是Caspase家族成員中執(zhí)行細胞凋亡的重要成員之一,在細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用,大多數(shù)促進細胞凋亡的因子,最終都通過激活Caspase-3而導致細胞凋亡。目前,已有TMPyP4抑制端粒酶活性的報道,但TMPyP4-PDT對促進惡性腫瘤細胞凋亡及對凋亡相關(guān)蛋白Survivin和Caspase-3的表達影響研究較少,本研究中我們通過觀察TMPyP4-PDT對裸鼠Hela細胞移植瘤的作用來探討其對宮頸癌細胞的促凋亡機制。 根據(jù)我們前期細胞實驗研究結(jié)果：TMPyP4-PDT對宮頸癌hela、siha細胞均有顯著殺傷作用,而宮頸癌hela、siha細胞對TMPyP4-PDT的敏感性不同,宮頸癌hela細胞較敏感。因此,我們動物實驗選擇宮頸癌hela細胞接種雌性BALB/c裸小鼠,觀察TMPyP4-PDT對裸鼠移植瘤的抑制作用。 因為PDT殺傷腫瘤細胞的效果取決于光敏劑濃度和光的能量密度,我們曾用光敏劑TMPyP4的較大濃度(20mg/kg)對裸鼠宮頸癌移植瘤行瘤周注射,發(fā)現(xiàn)在沒有激光照射的情況下就發(fā)生了皮膚潰爛,持續(xù)時間較長(四周)。預實驗時我們也曾選擇經(jīng)尾靜脈注射光敏劑給動物全身用藥(10mg/kg),發(fā)現(xiàn)光敏劑在尾靜脈中長時間聚集,避光四周,然后移至自然光線下放置2天發(fā)現(xiàn)裸鼠尾巴部分出現(xiàn)干性壞死(見圖1-2),而腫瘤增大明顯,生長未被抑制,裸鼠消瘦,提示全身用藥治療效果不理想。 綜上所述,為了較大限度的降低TMPyP4-PDT副反應(yīng),同時又能達到治療宮頸癌的效果,我們設(shè)計多次低劑量TMPyP4-PDT的治療方案,通過局部瘤體內(nèi)用藥方法來探討TMPyP4-PDT對宮頸癌的治療作用,并探討其促進宮頸癌細胞凋亡的機制。 第一部分：光敏劑TMPyP4多次低劑量光動力療法治療宮頸癌的動物實驗研究 研究目的：光動力療法(PDT)是一種近年研究發(fā)現(xiàn)的適合治療宮頸癌的新方法,但光動力療法的副作用有時是嚴重的,為了減少光敏療法副反應(yīng)的發(fā)生,又能在較大程度上達到治療惡性腫瘤的效果,我們設(shè)計本實驗來研究觀察TMPyP4多次低劑量光動力療法對裸鼠宮頸癌Hela細胞移植瘤的治療效果及副反應(yīng)。 材料與方法：雌性BALB/c裸小鼠(5-6周,稱重18-20克)20只,SPF級條件飼養(yǎng),裸鼠皮下注射宮頸癌Hela細胞(1×107細胞/200μL),瘤細胞接種10天后,達到標準的荷瘤小鼠為18只,標準成瘤率為90%,將荷瘤小鼠隨機分為三組,每組6只(n=6),A組為對照組,無任何治療；B組為一次用藥光療組,用TMPyP4(10mg/kg)瘤內(nèi)注射和照射藍色激光(108J／cm2)一次,藥物注射與激光照射間隔時間為6小時；C組為三次用藥光療組,用TMPyP4(10mg/kg)瘤內(nèi)注射和照射藍色激光(108J/cm2)三次,每次治療間隔時間2天。開始治療后,監(jiān)測腫瘤體積,在C組治療結(jié)束后2周,比較各組腫瘤體積大小,同時觀察裸鼠生活狀態(tài)以及皮膚和組織器官的損害情況及血液中血常規(guī)和肝腎功能的變化情況。 結(jié)果：C組移植瘤體積與A組和B組比較明顯受到抑制(P0.05)；而實驗結(jié)束時治療組裸鼠體重增加,生活狀態(tài)良好,對照組體重下降,生活狀態(tài)較差；另外治療組裸鼠皮膚和內(nèi)臟器官未見明顯損傷,血常規(guī)和肝腎功能與對照組相比無明顯變化,同時腫瘤切片HE染色發(fā)現(xiàn)C組移植瘤細胞凋亡明顯增多。 結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明,多次低劑量TMPyP4光動力治療可顯著抑制裸鼠宮頸癌移植瘤的生長、促進腫瘤細胞凋亡,治療組裸鼠生活狀態(tài)良好,未見消瘦,血常規(guī)和肝腎功能無明顯變化,同時皮膚及內(nèi)臟器官未見明顯副反應(yīng)發(fā)生。 第二部分：TMPyP4-PDT對宮頸癌裸鼠移植瘤細胞凋亡及Survivin和Caspase-3表達影響的研究 研究目的：細胞凋亡又稱細胞程序性死亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由一系列酶參與、多種基因控制的細胞自主有序的死亡過程。細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,目前細胞凋亡的確切機制仍不清楚,但細胞往往會激活相對立的兩個過程,凋亡和抗凋亡,由兩種信號通路的強弱對比決定最后的結(jié)局。所以,細胞凋亡一直是惡性腫瘤研究的熱點,也是藥物治療研究的靶點。有研究發(fā)現(xiàn),低劑量光敏劑光動力治療導致細胞凋亡,而高劑量光動力療法主要引起細胞壞死。我們采用原位末端標記法(TUNEL)研究觀察TMPyP4-PDT治療組宮頸癌細胞的凋亡情況,TUNEL法的原理是生物素或熒光素等標記物被標記在DNA缺口末端的3’-OH上,在TdT催化下,通過標記物顯色系統(tǒng)在組織細胞原位檢測凋亡細胞,對完整的單個凋亡細胞或凋亡小體進行原位染色,與普通HE染色方法相比,能更準確的反映細胞凋亡的形態(tài)特征并進行組間統(tǒng)計學分析對比。生存素(Survivin)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在細胞凋亡的發(fā)生機制中是兩個比較關(guān)鍵的因子,本研究聯(lián)合檢鋇Survivin和Caspase-3在裸鼠宮頸癌移植瘤中的表達,探討TMPyP4-PDT促進宮頸癌細胞凋亡的機制。 材料與方法：按照實驗第一部分分組情況,取各組移植瘤石蠟切片,用TUNEL法檢測腫瘤細胞的凋亡情況,用全自動熒光顯微鏡進行觀察和結(jié)果分析。TUNEL檢測方法為每例標本隨機取10個高倍視野,檢測1000個細胞中凋亡細胞所占百分比計數(shù)為凋亡指數(shù)(AI)。survivin和caspase-3蛋白的檢測采用免疫組化SP法,免疫組化陽性為細胞漿中棕黃色顆粒,采用全自動顯微鏡和圖像采集分析系統(tǒng),每只裸鼠選3張切片進行分析,每張切片連續(xù)讀取10張高倍視野,計算每視野陽性染色的光密度(0D)值,最后計算每組裸鼠的平均光密度值進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果：熒光強度檢測結(jié)果顯示, TUNEL陽性細胞以綠色熒光表示。TMPyP4-PDT三次治療組的TUNEL陽性(綠色熒光)細胞較單次治療組和對照組明顯增多,凋亡指數(shù)高于另外兩組,差異有顯著性意義；survivin和caspase-3蛋白免疫組化檢測結(jié)果顯示在三次治療組凋亡抑制因子survivin蛋白表達降低,凋亡關(guān)鍵因子caspase-3表達升高。 結(jié)論：多次低劑量TMPyP4-PDT療法對裸鼠移植瘤宮頸癌細胞有明顯的促凋亡作用,其機制可能與survivin蛋白表達降低和caspase-3表達升高有關(guān)。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：2584430